Мрэо гаи: Официальный сайт Госавтоинспекции

Содержание

МРЭО ГАИ — Полоцкий районный исполнительный комитет

ЭКЗАМЕНАЦИОННАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ

 

ДЕНЬ НЕДЕЛИ

ВРЕМЯ РАБОТЫ

Время работы подразделения

вторник — суббота

08.00 – 17.00

Выходные дни

воскресенье, понедельник

Обеденный перерыв

вторник — суббота

13.00 – 14.00

Прием документов

вторник — суббота

08.00 – 13.00

14.00 – 16.00

Прием теоретического экзамена

вторник — суббота

(вторник, среда – только автоучебные организации)

08.00 – 11.00

Прием практического экзамена

вторник — суббота

(вторник, среда – только автоучебные организации)

08.00 – 13.00

14.00 – 16.00

Выдача документов

вторник — суббота

16.00 – 17.00

· Прием теоретического и практического экзаменов проводится в зависимости от комплектования групп, но не реже 1 раза в час.

· Выдача водительских удостоверений осуществляется в кратчайшие сроки по мере их готовности но не позднее пяти дней. О времени получения гражданин заблаговременно уведомляется сотрудником РЭП.

Контакты +375 214 77-06-36

РЕГИСТРАЦИОННАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ

 

ДЕНЬ НЕДЕЛИ

ВРЕМЯ РАБОТЫ

Время работы

вторник — суббота

08.00 – 17.00

Выходные дни

воскресенье, понедельник

Обеденный перерыв

вторник — суббота

13.00 – 14.00

Оформление заявлений и бланков договоров

вторник — суббота

08.00 – 13.00

14.00 – 16.00

Выдача свидетельств о регистрации, копий учетно-регистрационных документов, справок

вторник — суббота

12.45 – 13.00

16.00 – 16.15

Осмотр транспорта

вторник — суббота

8.30, 10.00, 11.00, 12.00, 14.00,

15.00 (с 01.11 до 01.04)

15.40 (с 01.04 до 01.11)

Выдача свидетельств о регистрации осуществляется в кратчайшие сроки по мере их готовности но не позднее десяти дней.

ПРИМЕЧАНИЕ: Выход сотрудника на первый и последний осмотр транспорта может быть изменен начальником МРЭО ГАИ (осуществлен ранее или позже установленного распорядком времени) в зависимости от сезонного изменения продолжительности светового дня.

Как доехать до МРЭО ГИБДД в Советский Район на автобусе или маршрутке?

Общественный транспорт до МРЭО ГИБДД в Советский Район

Не знаете, как доехать до МРЭО ГИБДД в Советский Район, Россия? Moovit поможет вам найти лучший способ добраться до МРЭО ГИБДД от ближайшей остановки общественного транспорта, используя пошаговые инструкции.

Moovit предлагает бесплатные карты и навигацию в режиме реального времени, чтобы помочь вам сориентироваться в городе. Открывайте расписания, поездки, часы работы, и узнайте, сколько займет дорога до МРЭО ГИБДД с учетом данных Реального Времени.

Ищете остановку или станцию около МРЭО ГИБДД? Проверьте список ближайших остановок к пункту назначения: Ул. Доватора; Пр. А. И. Солженицына; Ул. Ерёменко.

Вы можете доехать до МРЭО ГИБДД на автобусе или маршрутке. У этих линий и маршрутов есть остановки поблизости: (Автобус) 26 (Маршрутка) 40, 48

Хотите проверить, нет ли другого пути, который поможет вам добраться быстрее? Moovit помогает найти альтернативные варианты маршрутов и времени. Получите инструкции, как легко доехать до или от МРЭО ГИБДД с помощью приложения или сайте Moovit.

С нами добраться до МРЭО ГИБДД проще простого, именно поэтому более 930 млн. пользователей доверяют Moovit как лучшему транспортному приложению. Включая жителей Советский Район! Не нужно устанавливать отдельное приложение для автобуса и отдельное приложение для метро, Moovit — ваше универсальное транспортное приложение, которое поможет вам найти самые обновленные расписания автобусов и метро.

МРЭО ГАИ | Житковичский районный исполнительный комитет

Межрайонное регистрационно-экзаменационное отдел a ГАИ Житковичского РОВД
Адрес:
247960, Республика Беларусь, Гомельская область, г. Житковичи, ул. Парковая, 1

Руководство:
Заместитель начальника ОГАИ – начальник МРЭО ГАИ Житковичского РОВД майор милиции

Котлерчук Ирина Сергеевна, тел. 80235355420

Прием граждан в МРЭО ГАИ Житковичского РОВД:

Вторник – с 09.00 до 13.00, Четверг – с 14.00 до 17.00, Суббота – с 09.00 до 13.00 ,

Среда – с 09.00 до 13.00, Пятница – с 09.00 до 13.00

Регион обслуживания:
Житковичский, Петриковский, Лельчицкий районы

Контактные телефоны:
8-02353-55425

Автоучебные организации находящиеся в зоне обслуживания МРЭО ГАИ Житковичского РОВД:

1.РОС ДОСААФ г. Житковичи

2.РОС ДОСААФ г.п. Лельчицы

3.РОС ДОСААФ г. Петриков

4.Филиал №16 ОАО «Гомельоблавтотранс» г. Житковичи

5.Государственный профессионально-технический лицей

г. Житковичи

6.Государственный профессионально-технический лицей

г.п. Лельчицы

7.Лунинецкий ДОСААФ г.Микашевичи

Регистрационная деятельность

Вид работы

День недели

Время работы

Оформление заявлений

вторник – суббота

с 8.00 до 13.00 и с 14.00 до 17.00.

Осмотр транспорта

вторник – суббота

с 8.30 до 12.45 и с 14.00 до 16.00*

Приём документов, регистрация договоров купли-продажи, мены, дарения

вторник – суббота

с 8.00 до 13.00 и с 14.00 до 16.00

Выдача документов

вторник – суббота

в 11.30, 12.30, 15.30, 16.30**

* — осмотр транспорта осуществляется в светлое время суток, время осмотра может изменяться в зависимости от количества обратившихся гр-н;

** — время выдачи документов может изменяться в зависимости от их готовности.

Экзаменационная деятельность

Вид работы

День недели

Время работы

Оформление заявлений

вторник – суббота

с 8.00 до 13.00 и с 14.00 до 16.00

Прием документов

вторник – суббота

с 8.00 до 13.00 и с 14.00 до 16.00

Прием теоретического экзамена

вторник — суббота

9.00, 10.00, 12.00, 14.30, 16.30*

Прием практического экзамена

вторник — суббота

с 11.00 до 13.00 и с 14.00 до 16.00*

Выдача документов

вторник-суббота

с 10.00, далее ежечасно**

* —приём теоретического и практического экзаменов может изменяться в зависимости от количества обратившихся граждан.

** — время выдачи документов может изменяться в зависимости от их готовности.

Информация для автовладельцев

Несвижский районный исполнительный комитет — МРЭО ГАИ

МРЭО ОГАИ Несвижского РОВД

Адрес: Несвижский р-н, г.п.Городея, ул.Вокзальная, 6.

Начальник: Будилович Виктор Вацлавович

График работы: вторник-суббота – 08.00-13.00, 14.00-17.00

Выходной: воскресенье, понедельник

Вид деятельности: осуществление процедур регистрации транспорта и экзаменационной деятельности.

Справки по телефону:

20231 – начальник
20844 – экзамены
20225 –  регистрация

20265 – инспектор по розыску

Распорядок работы МРЭО ОГАИ Несвижского РОВД

 

Регистрационная деятельность

 

День недели

Время работы

Оформление заявлений

вторник — суббота

08.00-13.00, 14.00-16.30

Осмотр транспорта

08.00-13.00, 14.00-16.00*

Прием документов, регистрация договоров купли-продажи, мены, дарения

08.00-13.00, 14.00-16.30

Выдача документов

11.30, 12.30, 15.30, 16.45

Комиссионный осмотр

вторник, пятница

14.00

Осмотр транспорта МРО ГАИ УВД с выездом в обслуживаемые районы

среда***

 

Экзаменационная деятельность

 

День недели

Время работы

Оформление заявлений

вторник — суббота

08.00-13.00, 14.00-16.30

Прием документов

Прием теоретического экзамена

вторник — суббота

10.00, 12.00, 15.00*

Прием практического экзамена

вторник — суббота

10.00-16.00*

Выдача документов

вторник — суббота

с 11.00, далее ежечасно**

Прием квалификационных экзаменов МЭО Г АИ УВД учебных групп и с выездом в обслуживаемые районы

вторник

среда***

09.00-16.00*

* время осмотра транспорта осуществляется в светлое время суток, приема теоретического и практического экзаменов может изменяться в зависимости от количества обращающихся граждан, прием квалификационного экзамена МЭО ГАИ УВД в г. Минске осуществляется четверг-суббота;

**  время выдачи может изменяться по мере готовности документов;

*** график выезда сотрудников МЭО ГАИ УВД в обслуживаемые районы по средам утвержден отдельно.

Зона обслуживания: Несвижский, Клецкий районы.

Бобруйск — Приемная горисполкома — Административные процедуры


По короткому телефонному номеру 142 населению предоставляется справочная информация в рабочие дни с 8.00 до 13.00, с 14.00 до 17.00:

­­­ ­
­­­­­­­

— об административных процедурах, прием и выдача документов по которым осуществляется через службу «одно окно» Бобруйского горисполкома и администраций районов г. Бобруйска;

— об адресах, номерах телефонов, режиме работы Бобруйского горисполкома, его структурных подразделений, городских служб, администраций районов г.Бобруйска.

— ­Справочная информация по телефону 142 предоставляется бесплатно. Звонок со стационарного телефона – по тарифам РУП «Белтелеком», с мобильного телефона (life, A1, MTC) – по тарифам операторов связи.

­
­ ­

Алгоритм действий граждан по возмещению части расходов на электроснабжение эксплуатируемого жилищного фонда для нужд отопления, горячего водоснабжения и пищеприготовления

ПАМЯТКА для граждан и рай(гор)исполкомов «Возмещение части расходов на электроснабжение эксплуатируемого жилищного фонда»

Нормативные правовые акты­­

Бобруйский горисполком в целях изучения эффективности деятельности организаций, оказывающих услуги, обеспечивающие жизнедеятельность населения, качества осуществления административных процедур предлагает Вам ответить на вопросы прилагаемой анкеты и  направить ее по электронной почте [email protected] ­

 

Анкета об эффективности деятельности организ­аций, оказывающих услуги обеспечивающие жизнедеятельность населения, качества осуществления административных процедур

АНКЕТА оценки эффективности работы службы «Одно окно»

­УВАЖАЕМЫЕ ПОСЕТИТЕЛИ!

В случае отказа в осуществлении административной процедуры заинтересованное лицо имеет право обжаловать его в вышестоящей организации — Могилевском областном исполнительном комитете ( г.Могилев, Первомайская, 71, рабочие дни:  понедельник — пятница с 8.00 до 13.00, с 14.00 до 17.00) и (или) в суд Бобруйского района и г.Бобруйска.  

 


Если Вы столкнулись со случаями:
— нарушения сроков осуществления административных процедур;  
— истребования от Вас для осуществления административных процедур документо­в, не включенных в перечень административных процедур;
— не обеспечения приема г­раждан в удобное для них время;
— отсутствия в приемное время на рабочем месте работника, осуществляющего прием граждан;
— длительного ожидания в очередях,
а также, ­если у Вас имеются конкретные предложения по упрощению административных процедур в Беларуси, Вы можете сообщить об этом нам на адрес электронной почты [email protected].
­

Мы сделаем все возможное, чтобы полученная информация была учтена при выработке предложений по совершенствованию правового регулирования административных процедур.
­ ­­ ________________________________________

­Под административной процедурой понимаются действия государственного органа, совершаемые в соответствии с определенной законодательством компетенцией на основании заявления заинтересованного лица, по установлению (предоставлению, удостоверению, подтверждению, регистрации, обеспечению), изменению, приостановлению, сохранению, переходу или прекращению прав и (или) обязанностей, в том числе заканчивающиеся выдачей справки или другого документа (его принятием, согласованием, утверждением), либо регистрацией или учетом заинтересованного лица, его имущества, либо предоставлением денежных средств, иного имущества и (или) услуг за счет средств республиканского или местных бюджетов, государственных внебюджетных фондов, из имущества, находящегося в республиканской или коммунальной собственности.­

МРЭО — это… Что такое МРЭО?

  • МРЭО — МРЭО  Межрайонный регистрационно экзаменационный отдел Государственной инспекции безопасности дорожного движения. Сфера деятельности: постановка транспортного средства на учёт[1]; снятие транспортного средства с учёта; замена номерных… …   Википедия

  • Мрэо — МРЭО  Межрайонный регистрационно экзаменационный отдел Государственной инспекции безопасности дорожного движения. Сфера деятельности: постановка транспортного средства на учет; снятие транспортного средства с учета; организация проведения… …   Википедия

  • МРЭО — межрайонный регистрационно экзаменационный отдел межрайонное регистрационно экзаменационное отделение ГИБДД Источник: http://for ua.com/ukraine/2007/11/19/132540.html Словарь: С. Фадеев. Словарь сокращений современного русского языка. С. Пб.:… …   Словарь сокращений и аббревиатур

  • ОП МРЭО — обособленное подразделение межрайонного регистрационно экзаменационного отдела …   Словарь сокращений и аббревиатур

  • Особые автомобильные номера в России — В данной статье описаны специальные виды государственных регистрационных знаков автомобилей, а также приведены некоторые серии регистрационных знаков в отдельных российских регионах, по которым можно определить ведомственную принадлежность… …   Википедия

  • ЕКХ — В данной статье описаны специальные виды государственных регистрационных знаков автомобилей, а также приведены некоторые серии регистрационных знаков в отдельных российских регионах, по которым можно определить ведомственную принадлежность… …   Википедия

  • Особые автомобильные номера — В данной статье описаны специальные виды государственных регистрационных знаков автомобилей, а также приведены некоторые серии регистрационных знаков в отдельных российских регионах, по которым можно определить ведомственную принадлежность… …   Википедия

  • Привилегированные автомобильные номера — В данной статье описаны специальные виды государственных регистрационных знаков автомобилей, а также приведены некоторые серии регистрационных знаков в отдельных российских регионах, по которым можно определить ведомственную принадлежность… …   Википедия

  • Привилегированные автомобильные номера России — В данной статье описаны специальные виды государственных регистрационных знаков автомобилей, а также приведены некоторые серии регистрационных знаков в отдельных российских регионах, по которым можно определить ведомственную принадлежность… …   Википедия

  • Автошкола — Автошкола  учебное заведение специального образования, предназначенное для подготовки водителей. В автошколе ведётся подготовка водителей к сдаче экзаменов на право управления транспортными средствами. Экзамены на право управления… …   Википедия

  • ГАИ разобралась с очередями в отделах регистрации

    https://sputnik.by/20210804/gai-razobralas-s-ocheredyami-v-otdelakh-registratsii-1055407344.html

    ГАИ разобралась с очередями в отделах регистрации

    ГАИ разобралась с очередями в отделах регистрации

    В МРЭО ГАИ в Ждановичах 4 августа выстроились длинные очереди из-за неработающей системы электронной очереди. 04.08.2021, Sputnik Беларусь

    2021-08-04T18:06+0300

    2021-08-04T18:06+0300

    2021-08-04T18:06+0300

    новости беларуси

    минск

    угаи гувд мингорисполкома

    /html/head/meta[@name=’og:title’]/@content

    /html/head/meta[@name=’og:description’]/@content

    https://cdnn11.img.sputnik.by/img/07e5/08/04/1055407311_0:121:1280:841_1920x0_80_0_0_f2b94390b40fdc0f5a3b0a094965fda1.jpg

    МИНСК, 4 авг – Sputnik. Сотрудники ГАИ оформили в МРЭО в среду свыше тысячи заявлений автовладельцев, очередей в отделе регистрации во второй половине дня не было, сообщили в управлении Госавтоинспекции Мингорисполкома.Как ранее писал Sputnik, в МРЭО ГАИ в Ждановичах 4 августа выстроились длинные очереди из-за неработающей системы электронной очереди. В отдельные часы очередь выходила за пределы помещения регистрационного отдела и даже растягивалась на площади торговых павильонов.»В связи с большим притоком граждан, желающих осуществить регистрационные действия, периодически возникают очереди в регистрационных подразделениях ГАИ. Сотрудниками МРО ГАИ ГУВД Мингорисполкома предпринимаются все меры для оперативного обслуживания граждан», – сказали в инспекции.Там также уточнили, что все посетители были приняты, а сотрудники оформили в среду более тысячи заявлений.Читайте также:

    новости беларуси

    минск

    Sputnik Беларусь

    [email protected]

    +74956456601

    MIA „Rosiya Segodnya“

    2021

    Sputnik Беларусь

    [email protected]

    +74956456601

    MIA „Rosiya Segodnya“

    Новости

    ru_BY

    Sputnik Беларусь

    [email protected]

    +74956456601

    MIA „Rosiya Segodnya“

    https://cdnn11.img.sputnik.by/img/07e5/08/04/1055407311_0:1:1280:961_1920x0_80_0_0_c418c9a8603a8a1ad6e0205eb4ad270e.jpg

    Sputnik Беларусь

    [email protected]

    +74956456601

    MIA „Rosiya Segodnya“

    Sputnik Беларусь

    [email protected]

    +74956456601

    MIA „Rosiya Segodnya“

    новости беларуси, минск, угаи гувд мингорисполкома

    Подписаться на

    В МРЭО ГАИ в Ждановичах 4 августа выстроились длинные очереди из-за неработающей системы электронной очереди.

    МИНСК, 4 авг – Sputnik. Сотрудники ГАИ оформили в МРЭО в среду свыше тысячи заявлений автовладельцев, очередей в отделе регистрации во второй половине дня не было, сообщили в управлении Госавтоинспекции Мингорисполкома.

    Как ранее писал Sputnik, в МРЭО ГАИ в Ждановичах 4 августа выстроились длинные очереди из-за неработающей системы электронной очереди. В отдельные часы очередь выходила за пределы помещения регистрационного отдела и даже растягивалась на площади торговых павильонов.

    «В связи с большим притоком граждан, желающих осуществить регистрационные действия, периодически возникают очереди в регистрационных подразделениях ГАИ. Сотрудниками МРО ГАИ ГУВД Мингорисполкома предпринимаются все меры для оперативного обслуживания граждан», – сказали в инспекции.

    Там также уточнили, что все посетители были приняты, а сотрудники оформили в среду более тысячи заявлений.

    «Во второй половине дня очередь для подачи документов не наблюдалась», – заключили в ГАИ.

    Читайте также:

    Как ГАИ проводит эксперименты и чем это заканчиваетсяЛегковушка влетела в ограждение моста под Быховом: есть пострадавшие

    Марио Гай

    Астроном-исследователь в INAF — Osservatorio Astrofisico di Torino
    Руководство SPIE: Получение данных, пожалуйста, подождите…
    Участие SPIE: Получение данных, пожалуйста, подождите…

    Контактная информация:

    Войдите, чтобы отправить личное сообщение или просмотреть контактную информацию

    Предстоящие презентации

    Самые последние | Показать все

    Получение данных, пожалуйста, подождите…

    Публикации

    Самые последние | Показать все

    Получение данных, пожалуйста, подождите…

    Участие комитета конференции

    Самые последние | Показать все

    Получение данных, пожалуйста, подождите…

    Инструктор курса

    Самые последние | Показать все

    Получение данных, пожалуйста, подождите…

    Инжиниринг распределения — Консультанты ГАИ

    GAI предлагает ряд опытных специалистов по проектированию распределительных сетей, помогающих клиентам коммунальных служб поставлять своим клиентам надежную, безопасную и бесперебойную энергию с подстанций. Мы предоставляем инновационный опыт для проектирования, строительства, технического обслуживания и расширения всего спектра надземных и подземных сооружений распределения энергии.

    Клиенты в сфере энергетики полагаются на GAI в плане комплексного проектирования и проектирования распределительных сетей — от анализа нагрузки и оценки маршрута до разработки проекта и контроля за строительством. Мы сотрудничаем с клиентами для оценки текущих и будущих потребностей, а также реализуем инициативы по проектированию распределительных сетей, начиная с обследования, выдачи разрешений и маршрутизации, заканчивая проектированием, строительством и текущей эксплуатацией.

    Наши специалисты предлагают комплексные решения для воздушных линий/сооружений, подземных линий/люков, укрепления инфраструктуры, изменения маршрута, проектирования преобразования воздушных линий в подземные и многого другого.GAI объединяет многие дисциплины, жизненно важные для успешных инициатив по распространению, предоставляя услуги, ориентированные на клиента, которые приводят к устойчивым решениям.

    Услуги распределительной линии

    • Модернизация системы/линии и повышение надежности
      • Перепроводка
      • Автоматическая установка устройств — AFS и Intellirupters
      • Замена оборудования/оборудования – предохранители, колпачок. Банки, Изоляторы, Траверсы
    • Проектирование каркаса и переносы
    • Подготовка к совместному использованию, анализ и проектирование
    • Проект переоборудования подвесной системы в подземную
    • Анализ опор, замена и/или укрепление
      (PLSPOLE, Pole Foreman и O-Calc)
    • Расширение системы/Новый дизайн линии/Новый бизнес
    • Новые воздушные и подземные установки
    • Упрочнение подземной инфраструктуры
      (Кабели/люки/каналы)
    • Создание спецификации и разработка чертежей
    • Разрешение на временное закрытие дороги
    • Парень

       

    226-005-ГАИ-Троникс С.М.А.Р.Т. Прочный телефон с клавиатурой (226-005)

    В настоящее время доступно только 0 единиц. Вы уже добавили максимально доступное количество.

    Пожалуйста, нажмите кнопку «Купить сейчас» ниже, чтобы купить эти 0 до того, как они исчезнут.

    В настоящее время доступно только 0 единиц.Вы уже добавили максимально доступное количество.

    Пожалуйста, нажмите кнопку «Купить сейчас» ниже, чтобы купить эти 0 до того, как они исчезнут.

    В настоящее время доступно только 0 единиц. У вас уже есть количество 0 в вашей корзине.

    Чтобы купить другой по распродажным ценам, нажмите кнопку «Купить сейчас» под номером

    .

    Вы уже добавили 0 единиц этого товара в свою корзину, которые у нас есть в наличии на распродаже для этого товара.

    Если вы хотите купить больше, чем 0, у вас есть возможность купить из нашего ассортимента по обычной цене. У нас есть количество 0, доступное по обычной цене 0,00 долларов США за штуку.

    Если вы хотите продолжить, вы можете сделать это, воспользовавшись ссылкой «Купить акции по обычной цене» ниже, или закрыть это всплывающее окно, чтобы купить до нулевого количества этого товара по распродажной цене.

    В настоящее время у нас есть 0 доступных для распродажи товаров по цене 0 долларов США.00/каждый.

    Если вы хотите купить больше, чем 0, у вас есть возможность приобрести остаток из нашего ассортимента по обычной цене. У нас есть количество 0, доступное по обычной цене 0,00 долларов США за штуку.

    Если вы хотите продолжить, нажмите кнопку «Купить обычные и распродажные акции» ниже. Это действие добавит 0 единиц, которые у нас есть в наличии по цене 0,00 долл. США за каждую, и единиц(и) по цене 0,00 долл. США за каждую в вашу корзину для оформления заказа.

    Если вам нужны только 0 единиц по распродажной цене, нажмите кнопку «Купить только распродажу» ниже, и мы автоматически заполним поле количества для количества 0 по распродажной цене.

    В настоящее время у нас есть 0 штук по распродажной цене. Вы уже добавили количество 0 в корзину.Вы можете добавить другое количество в корзину из раздела оформления. Чтобы добавить дополнительное количество в корзину, нажмите кнопку ниже.

    Если вы хотите купить больше, чем 0, у вас есть возможность приобрести остаток из нашего ассортимента по обычной цене. У нас есть количество 0, доступное по обычной цене 0,00 долларов США за штуку.

    Если вы хотите продолжить, вы можете сделать это, нажав кнопку «Купить инвентарь по обычной цене» ниже, или закрыть это всплывающее окно и ввести дополнительное количество этого товара, которое вы хотите купить по распродажной цене.

    ГЛОБАЛЬНЫЕ ИНВЕСТИЦИИ

    22 октября 2021 г.

    Мишель Пеллетье Маршалл, Global AgInvesting Media

    Таня Хавеманн основала Clarmondial в Цюрихе в 2010 году с целью создания ценности за счет активной разработки и внедрения инвестиционных решений для поддержки устойчивого управления природными ресурсами.

    Clarmondial предоставляет инвестиционные консультации ведущим инвесторам, компаниям, фондам, природоохранным организациям и правительствам по вопросам мобилизации концессионных и коммерческих ресурсов.Недавняя работа включает в себя помощь ведущей компании, ориентированной на потребителей, заручиться поддержкой своих поставщиков со стороны учреждения финансирования развития (DFI), помощь крупной корпорации в реализации ее стратегии углеродной нейтральности посредством кредитных закупок и инвестиций в установление, а также руководство институциональными инвесторами в их сельском хозяйстве. и инвестиционные стратегии в лесном хозяйстве. Clarmondial также работает с Морским попечительским советом над расширением масштабов их Фонда попечительства над океаном. Clarmondial управляет своей глобальной деятельностью с помощью команд, базирующихся в Швейцарии, Кот-д’Ивуаре, Кении и Коста-Рике.

    Компания Clarmondial разработала Фонд продовольственных ценных бумаг, открытый частный кредитный фонд, предназначенный для институциональных инвесторов, стремящихся получить прибыль, ликвидность и влияние. Фонд, который начал свою деятельность в марте 2021 года, является инновационным, поскольку он использует покупательную способность крупных корпораций и гарантию, предоставленную правительством США (DFC) в рамках Бюро USAID по устойчивости и продовольственной безопасности. Clarmondial выступает в качестве советника Фонда продовольственной безопасности, который недавно получил подписку от Global Environment Facility/Conservation International в знак признания вклада Фонда в смягчение последствий изменения климата, сохранение биоразнообразия, обращение вспять деградации земель и поддержку сельских общин.

    Чтобы узнать больше, Новости GAI связались с Хавеманн в ее офисе в Цюрихе.

    1). Ответственное инвестирование и рассмотрение стратегии ESG в настоящее время кажутся модными словечками аграрного инвестирования. Вы занимаетесь этим уже более двух десятилетий — какие сдвиги вы заметили в аграрном инвестировании из-за этого и как вы видите его развитие?  

    Обнадеживает растущая приверженность корпораций и инвесторов устойчивому развитию.Помимо требований и правил раскрытия информации, более крупные корпорации, управляющие цепочками поставок, реагируют на призывы к действию со стороны потребителей и инвесторов. Во многих случаях эти корпорации уже наблюдают, как изменение климата влияет на их поставщиков. Инвесторы также более серьезно относятся к этой теме и готовы вкладывать капитал в устойчивые инвестиции в сельское хозяйство.

    Пандемия COVID-19 показала, насколько уязвимы некоторые цепочки поставок. С изменением климата мы ожидаем нехватки и нестабильности поставок, и ожидается, что дальнейшее давление на компании повысит требования к прозрачности и отслеживаемости в их цепочках поставок.Факторы устойчивости также играют все более важную роль в обеспечении безопасности бизнеса в более конкурентной рыночной среде, в том числе для брендов, посредников и производителей. Недавний отчет Массачусетского технологического института [1] подтверждает, что крупные компании, в частности, еще больше сосредоточены на устойчивости цепочки поставок после COVID-19. Крупные компании должны будут все более внимательно относиться к тому, как они взаимодействуют с поставщиками, чтобы стимулировать долгосрочные отношения.

    Это имеет последствия для финансирования и инвестиций.Устойчивое развитие является частью управления операционным риском и, следовательно, является фактором кредитного риска. Например, перерабатывающая компания может столкнуться с финансовыми трудностями, если она не сможет найти достаточно сырья из-за засухи, которая повлияет на сельскохозяйственную продукцию в ее цепочке поставок. Работа с фермерами над посадкой засухоустойчивых семян и оказание поддержки в течение всего сезона для внедрения других экологически чистых методов может помочь стабилизировать поставки этой компании, тем самым снизив ее кредитный риск.Это очень важно, поскольку трейдеры и агрегаторы, особенно на развивающихся рынках, сталкиваются с растущим кредитным разрывом, особенно в отношении оборотного капитала. Это усугубляется тем, что глобальные банки и традиционные кредиторы уходят со многих из этих рынков и из сельского хозяйства в целом.

    2). Можете ли вы привести несколько примеров успеха Clarmondial в управлении земельными, лесными или сельскохозяйственными решениями/инвестициями/портфелями?

    Мы работаем с ведущим брендом кофе в течение нескольких лет, помогая им получить как льготное, так и коммерческое финансирование для поддержки инициатив по устойчивой цепочке поставок.Мы также работали с одним из крупнейших европейских пенсионных фондов над приведением их стратегии инвестиций в сельское и лесное хозяйство в соответствие с таксономией ЕС. Институциональные инвесторы должны пересмотреть инвестиционные стратегии и портфели, а также ту информацию, которую они могут реально получить от объектов инвестиций, чтобы соответствовать новым правилам и передовой практике. Другим примером является работа, которую мы проделали с агробизнесом, помогая ему структурировать зеленые облигации и взаимодействовать с учреждениями финансирования развития (DFI) и частными инвесторами воздействия.И, конечно же, мы играем ведущую роль в руководстве развитием Фонда продовольственных ценных бумаг, который предоставляет дополнительное финансирование агробизнесу на развивающихся рынках.

    3). Вы упоминаете Фонд продовольственных ценных бумаг, который был запущен в марте 202 1 . Не могли бы вы предоставить некоторые подробности об этом?

    Компания Clarmondial начала работать над концепцией Фонда около пяти лет назад.Опираясь на нашу работу с крупными корпорациями и их поставщиками, мы заметили увеличивающийся дефицит оборотного капитала. Многие корпорации берут на себя все более строгие обязательства в области устойчивого развития, но их поставщики, в частности малые и средние предприятия (МСП), с трудом выполняют их из-за ограниченного доступа к финансированию, даже если у них есть связи с местными банками и другими традиционными и влиятельными кредиторами. Мы увидели сбой рынка, когда такие спонсоры не могут помочь, даже если у этих поставщиков давние торговые отношения.

    Мы также регулярно общаемся со многими институциональными инвесторами и увидели, что в области инвестирования с влиянием больше интереса к регулируемым, достаточно ликвидным и хорошо структурированным продуктам. Учитывая процентные ставки во многих развитых странах, было интересно разработать продукт, который мог бы обеспечить дополнительное финансирование по конкурентоспособным ставкам для этих сельскохозяйственных производственно-сбытовых цепочек за счет использования существующих отношений с крупными кредитоспособными корпорациями. Мы понимаем цепочки поставок в сельском хозяйстве, поэтому мы основывали инвестиционную стратегию на продовольственном финансировании[2] и архитектуре цепочки поставок вместо того, чтобы довольствоваться обычной моделью кредитования под залог активов.

    В дополнение к снижению рисков, связанных с цепочкой поставок, Фонд продовольственных ценных бумаг также имеет гарантийный механизм от правительства США. Это «фонд смешанного финансирования», объединяющий государственный и частный капитал.

    Фонд ценных бумаг позволяет заемщикам больше и лучше вести дела с фермерами в течение всего сельскохозяйственного сезона, повышать прозрачность, укреплять отношения в цепочке поставок и добиваться прогресса в решении социальных и экологических проблем, включая климат, занятость в сельской местности, гендерные аспекты и методы управления земельными ресурсами.Мы также хотим, чтобы крупные корпорации, которые часто давали публичные заявления о своих цепочках поставок, начали предпринимать более значимые действия и поддерживать своих поставщиков в достижении этих общих целей. Например, они могут добиться этого, помогая поставщикам получить доступ к кредитам из Фонда продовольственных ценных бумаг.

    4). Есть ли сумма в долларах, связанная с новым Фондом продовольственных ценных бумаг?

    Фонд поддерживается крупными американскими инвесторами, в том числе крупными американскими инвесторами.S. фонды и семейный офис. Фонд также получил подписку от Conservation International в рамках объявленного в сентябре Глобального экологического фонда обязательства в размере 15 миллионов долларов. ГЭФ — это многосторонний фонд, представляющий Рамочную конвенцию ООН об изменении климата, Конвенцию ООН о биологическом разнообразии и Конвенцию ООН по борьбе с опустыниванием. И я рад сообщить, что Clarmondial инициировала несколько транзакций для Фонда, и уже в первый год своего существования Фонд продовольственных ценных бумаг повлиял на жизнь более 10 000 мелких фермеров.

    5). Как, на ваш взгляд, продвигается работа Фонда?

    Мы расширяем портфель Фонда, чтобы улучшить его репутацию с финансовой точки зрения и с точки зрения воздействия. Пенсионные фонды, банки и страховые компании, а также семейные офисы уже проявляют интерес к инвестициям. Один аспект, который они ценят, заключается в том, что Фонд классифицируется как «темно-зеленый» фонд статьи 9[3] в соответствии с Европейским регламентом по раскрытию информации об устойчивом финансировании.

    Clarmondial продолжит поставлять ресурсы для Фонда, уделяя особое внимание странам Африки к югу от Сахары.Кроме того, мы рассматриваем сделки в Латинской Америке и Юго-Восточной Азии. Clarmondial продолжает расширять свои партнерские отношения по финансированию поставщиков с крупными компаниями и трейдерами, ориентированными на потребителей. И, наряду с Фондом, Clarmondial видит дополнительные возможности для помощи в мобилизации дополнительного долгосрочного финансирования, например, для нужд восстановления ландшафта.

    6). Участники GAI, как и ваши клиенты, являются институциональными инвесторами, государственными учреждениями, семейными офисами, предпринимателями и т. д., стремящимися привлечь инвестиции в устойчивое управление природными ресурсами.На какие основные области, такие как климатическое финансирование или связывание углерода, вы бы посоветовали им обратить пристальное внимание?

    Я бы посоветовал им обратить внимание на решения, связанные с естественным климатом, и пространство решений, основанных на природе, а также подумать о том, как встроить в финансовые структуры обязательства, связанные с климатом, биоразнообразием и другими обязательствами, связанными с цепочками поставок.

    Мы видим, что ведущие компании, ориентированные на потребителей, хотят реализовать свои инвестиции в климатическую нейтральность в своих областях и секторах производства.Консультируя клиентов по этому вопросу, мы уделяем особое внимание целостности, добровольным и регулируемым рынкам, а также обеспечению того, чтобы наши клиенты и партнеры правильно понимали различные углеродные рынки.

    Другой связанной темой является смешанное финансирование. В последнее время этому уделяется повышенное внимание. Я думаю, что с сокращением помощи в целях развития и ограниченным государственным бюджетом мы увидим больше готовности со стороны государственных и частных спонсоров играть роль в мобилизации дополнительного частного капитала. У нас есть практический опыт в этом, в том числе в структурировании транзакций и инвестиционных инструментов, а также в идейном лидерстве[4].Как и в случае климатического финансирования, затраты на смешанные транзакции могут быстро перевесить выгоды, если стратегия неясна или у вас нет нужного опыта.

    Наконец, я думаю, что мы увидим больше внимания к подходам к цепочке создания стоимости, с усилением инвестиционных стратегий и возможностей, развивающихся вокруг этой темы.

     КОНЦЕВЫЕ ПРИМЕЧАНИЯ:

    [1] https://sscs.mit.edu

    [2] https://www.worldbank.org/en/topic/agriculture/publication/food-finance-architecture-financing-a-healthy-equitable-and-sustainable-food-system

    [3] https://www.fieldfisher.com/en/insights/light-green-and-dark-green-funds-under-the-sfdr

    [4] Таня Хавеманн, Кристин Негра и Фред Вернек, 2020 г. «Смешанное финансирование для сельского хозяйства: изучение ограничений и возможностей комбинирования финансовых инструментов для устойчивого перехода», «Сельское хозяйство и человеческие ценности», Springer; «Сельское хозяйство, продовольствие и человеческие ценности». Общество (AFHVS), vol. 37(4), страницы 1281-1292, декабрь.

    О ТАНЕ ХАВЕМАНН

    Таня Хавеманн является соучредителем и директором Clarmondial, независимой консалтинговой компании, созданной в 2010 году для содействия инвестициям, связанным с повышением эффективности использования природных ресурсов.Хавеманн имеет 20-летний опыт работы в секторе экологического финансирования, в том числе в британской компании по управлению активами, ориентированной на низкоуглеродную экономику. Она является членом правления различных организаций, ориентированных на устойчивое развитие, и опубликовала различные отчеты и документы о климате и смешанном финансировании. Хавеманн имеет степень магистра права и политики в области окружающей среды Кентского университета, степень магистра прикладной экономики окружающей среды (Имперский колледж Лондона) и степень бакалавра (с отличием) тропической экологии Университета Абердина.

     

     

    6 — Michelle Pelletier Marshall является предоставление редактора и автора для партнеров Highquest GAI News и News News Moxseed & Gree , а также управление редактором для его WIA сегодня блог. Кроме того, она является PR / медиа-менеджером компании. С ней можно связаться по телефону [email protected] .

    Безопасность | Стеклянная дверь

    Пожалуйста, подождите, пока мы проверим, что вы реальный человек.Ваш контент появится в ближайшее время. Если вы продолжаете видеть это сообщение, отправьте электронное письмо чтобы сообщить нам, что у вас возникли проблемы.

    Veuillez терпеливейший кулон Que Nous vérifions Que Vous êtes une personne réelle. Votre contenu s’affichera bientôt. Si vous continuez à voir ce сообщение, связаться с нами по адресу Pour nous faire part du problème.

    Bitte warten Sie, während wir überprüfen, dass Sie wirklich ein Mensch sind. Ихр Inhalt wird в Kürze angezeigt.Wenn Sie weiterhin diese Meldung erhalten, Информировать Sie uns darüber bitte по электронной почте и .

    Эвен Гедульд А.У.Б. terwijl мы verifiëren u een человек согнуты. Uw содержание wordt бинненкорт вергегевен. Als u dit bericht blijft zien, stuur dan een электронная почта naar om ons te informeren по поводу ваших проблем.

    Espera mientras verificamos Que eres una persona real. Tu contenido se sostrará кратко. Si continúas recibiendo este mensaje, информация о проблемах enviando электронная коррекция .

    Espera mientras verificamos Que eres una persona real. Tu contenido aparecerá en краткий Si continúas viendo este mensaje, envía un correo electronico a пункт informarnos Que Tienes Problemas.

    Aguarde enquanto confirmamos que você é uma pessoa de verdade. Сеу контеудо será exibido em breve. Caso continue recebendo esta mensagem, envie um e-mail para Para Nos Informar Sobre O Problema.

    Attendi mentre verificiamo che sei una persona reale.Il tuo contenuto verra кратко визуализировать. Se continui a visualizzare questo message, invia удалить все сообщения по электронной почте indirizzo для информирования о проблеме.

    Пожалуйста, включите Cookies и перезагрузите страницу.

    Этот процесс выполняется автоматически. Вскоре ваш браузер перенаправит вас на запрошенный вами контент.

    Пожалуйста, подождите 5 секунд…

    Перенаправление…

    Код: CF-102/6fa656d9596735a1

    Перекрестные помехи в передаче сигналов гормонов растений: о чем нам говорят мутанты арабидопсиса

    Abstract

    Генетические скрининги оказались чрезвычайно полезными для идентификации генов, участвующих в передаче сигналов гормонов.Однако, хотя эти скрининги изначально были разработаны для выявления специфических компонентов, участвующих в ранней передаче сигналов гормонов, мутации в этих генах часто вызывают изменения чувствительности более чем к одному гормону на уровне всего растения. Кроме того, с помощью скрининга, который изначально был разработан для выявления регуляторов метаболизма сахара, было идентифицировано множество генов гормонального ответа. В совокупности эти факты указывают на то, что линейного представления сигнальных путей гормонов, контролирующих определенный аспект роста и развития растений, недостаточно, и что гормоны взаимодействуют друг с другом и с различными онтогенетическими и метаболическими сигналами.После появления молекулярной генетики арабидопсиса мы начинаем понимать некоторые механизмы, с помощью которых гормон преобразуется в клеточный ответ. В этом ботаническом брифинге мы рассматриваем подмножество генов арабидопсиса, которые влияют на гормональные перекрестные помехи, с акцентом на пути гиббереллина, абсцизовой кислоты и этилена. В некоторых случаях оказывается, что модуляция чувствительности к гормонам может вызывать изменения в синтезе неродственного гормона, в то время как в других случаях ген гормонального ответа определяет узел взаимодействия между двумя путями ответа.Также кажется, что различные гормоны могут конвергировать, чтобы регулировать оборот важных регуляторов, участвующих в росте и развитии. Приводятся примеры недавнего использования анализа супрессоров и энхансеров для выявления новых узлов взаимодействия между этими путями.

    Ключевые слова: Развитие, гормоны, арабидопсис, генетические взаимодействия. растительные процессы (Davies, 1995).С появлением молекулярной генетики и, в частности, с использованием модельной генетической системы Arabidopsis thaliana (арабидопсис) молекулярная основа того, как синтез гормонов превращается в клеточный ответ, в настоящее время расшифровывается. Отдельные компоненты, такие как рецепторы, сигнальные интермедиаты, т.е. киназы и фосфатазы, а также нижележащие факторы транскрипции были идентифицированы как играющие специфические роли в передаче сигналов гормонов (McCourt, 1999). Однако идентификация отдельных компонентов путей передачи гормонального сигнала имеет ограниченную помощь в понимании того, как растение использует гормоны для координации общего роста и развития.Одна конкретная загадка заключается в том, как один гормон может влиять на такое множество не связанных между собой реакций, и в то же время множество разных гормонов могут влиять на один и тот же процесс. Например, было показано, что ауксин опосредует клеточное деление, развитие придаточных корней, апикальное доминирование и экспансию клеток. Однако гиббереллин (GA) и брассиностероиды (BR) также, по-видимому, регулируют рост клеток. Влияют ли все эти соединения на разные аспекты клеточной экспансии или все они модулируют один и тот же шаг? Законсервирован ли молекулярный механизм для всех процессов, на которые влияет один гормон? На первый взгляд, генетический анализ предполагает, что гормоны работают по разным путям, чтобы вызвать свои ответы, и, возможно, взаимодействуют только отдаленно по течению от их основного пути реакции.Однако недавний фенотипический анализ мутантов, отвечающих на гормоны, предполагает, что эти молекулы могут влиять на синтез друг друга и, возможно, могут иметь общие сигнальные компоненты. Целью этого ботанического брифинга является описание некоторых генетических подходов, которые привели к убеждению, что гормоны взаимодействуют или взаимодействуют друг с другом, образуя сложную сеть перекрывающихся сигналов. Мы ограничили наш анализ арабидопсисом и несколькими избранными путями, которые особенно полезны для обсуждения генетического взаимодействия.Мы заканчиваем предположениями о том, как гормоны могли эволюционировать, чтобы координировать общий рост и развитие растений.

    ГЕНЫ, РЕГУЛИРУЮЩИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ГОРМОНАМ

    Этилен; Я чувствую запах газа

    Изучение передачи гормонов генетическим глазом оказалось наиболее успешным для понимания того, как сигнал этилена воспринимается и передается в арабидопсисе (обзор см. Wang et al ., 2002). Этот успех в основном связан с анализом физиологического роста, который использовался для определения мутантов, реагирующих на этилен.Выращенные в темноте проростки дикого типа, постоянно подвергающиеся воздействию этилена, демонстрируют то, что было названо фенотипом «тройной реакции»: преувеличенная кривизна апикального крючка, а также толстый и короткий корень и гипокотиль. Мутанты, которые не давали тройной реакции в присутствии этилена, классифицировались как нечувствительные к этилену мутанты, в то время как растения, демонстрирующие тройную реакцию в отсутствие газа, считались либо производящими этилен в избытке, либо конститутивными для реакции на этилен.

    Комбинация генетических, молекулярных и биохимических экспериментов позволила собрать воедино следующий сценарий: этилен связывается с одним или несколькими членами семейства двухкомпонентных рецепторных киназ, ETR1, ETR2, EIN4, ERS1 и ERS2, а затем инактивирует их (рис. А). Гормональная инактивация семейства рецепторов передается через неизвестный механизм RAF-подобной серин/треонинкиназе, обозначенной как CTR1 (Kieber et al. ., 1993). В присутствии этилена инактивация CTR1, в свою очередь, дерепрессирует EIN2 , позитивный регулятор пути ответа на этилен (Roman et al ., 1995). Ген EIN2 кодирует мембранный белок, N-конец которого демонстрирует слабое сходство последовательностей с семейством переносчиков металлов NRAMP млекопитающих, при этом С-концевой участок белка является новым (Alonso et al. ., 1999). Новизна EIN2 и неспособность проявлять какую-либо активность по переносу металлов затрудняют установление функции этого белка в передаче сигналов этилена. Наконец, также были идентифицированы генетически определенные нижележащие компоненты EIN2 , такие как EIN3 , который кодирует фактор транскрипции, и EIN5 и EIN6 , которые кодируют белки с неизвестной функцией (Chao et al ., 1997).

    Рис. 1. Три сигнальных пути гормонов, определенные генетическим и молекулярным анализом. А. В отсутствие этилена семейство рецепторов этилена (ETR1, ETR2, ERS1, ERS2, EIN4) активирует CTR1, который, в свою очередь, подавляет положительный мембранный белковый регулятор EIN2. Добавление этилена инактивирует рецепторы этилена, что приводит к инактивации CTR1, тем самым высвобождая EIN2 для активации EIN3. Фактор транскрипции EIN3 связывается с регуляторными последовательностями в промоторе регулируемых этиленом генов, индуцирующих транскрипцию.B, Рецептор ABA для ABA не определен. Однако генетически ниже рецепции АБК, дефосфорилирования (ABI1/2), фарнезилирования белка (ERA1) и процессинга РНК (ABh2) необходимы для ослабления сигнала АБК. В нижней части пути три фактора транскрипции (ABI3, ABI4, ABI5) ответственны как минимум за чувствительность семян к АБК. C. Рецептор для GA не определен. Однако в отсутствие ГА семейство факторов транскрипции (GAI, RGA, RGL1 и RGL2) ингибирует различные ответы, опосредованные ГА.Через неизвестные механизмы ГА противодействует этим белкам, что приводит к экспрессии генов, регулируемых ГА. Также считается, что SLY1 и SPY регулируют эти репрессоры транскрипции. Зеленые молекулы указывают на факторы транскрипции, синие молекулы указывают на сигнальные интермедиаты, а желтые молекулы представляют собой рецепторы. Стрелки представляют положительное регулирование, а столбцы представляют отрицательное регулирование.

    Абсцизовая кислота; останавливаясь на отрицательном

    Идентификация генов, участвующих в передаче сигналов абсцизовой кислоты (АБК), обычно включала скрининг, основанный на ингибировании прорастания семян или измененной экспрессии генов экзогенно применяемой АБК.Вообще говоря, были идентифицированы два класса мутантов. Мутации, придающие фенотип гиперчувствительности к АБК, показали, что фарнезилирование белка ( ERA1 ), передача сигналов инозита ( FRY1 ) и процессинг РНК ( ABh2 , SAD1 , HYL1 ) необходимы для ослабления реакции АБК ( HYL1 ). Cutler et al. ., 1996; Lu and Federoff, 2000; Hugouvieux et al. ., 2001; Xiong et al. ., 2001 a , b ).Напротив, мутации, которые снижают чувствительность семян к ABA, предполагают, что дефосфорилирование ( ABI1 , ABI2 ) и транскрипция ( ABI3 , ABI4 , ABI5 ) также важны (Giraudat 9.9, 179191 et al.). et al. ., 1994; Meyer et al. ., 1996; Leung et al. ., 1997; Finkelstein et al. ., 1998; Finkelstein and Lynch, 2000; 2000). Используя комбинацию супрессорного и эпистатического анализа, оказалось, что ABI1/2 действуют на уровне ERA1 или выше и что оба этих гена работают на уровне ABI3 и ABI5 или выше (рис.Б; Парси и Жиродат, 1997 г.; Pei и др. , 1998; С. Брэди перс. комм.). Недавние исследования показали, что ABI3 и ABI5 взаимодействуют в дрожжевом двухгибридном анализе взаимодействия белков, что согласуется с их принадлежностью к одному и тому же генетическому пути (Nakamura et al. ., 2001). Результаты комбинации двойных мутантов с потерей функции и неправильной экспрессией между ABI3 , ABI4 и ABI5 позволяют предположить, что эти три фактора транскрипции взаимодействуют сложным образом, определяя общую чувствительность семян ABA (Söderman et al ., 2000). Анализ двойных мутантов между abh2 и abi1 предполагает, что эти гены находятся в разных генетических путях, и это подтверждается наблюдением, что двойные мутанты era1 и abh2 являются аддитивными в отношении гиперчувствительности к АБК (Hugouvieux et al. ., 2001).

    В отличие от анализа тройного отклика, который, по-видимому, представляет собой специфический выходной ответ арабидопсиса на применение этилена, на прорастание может влиять множество внешних и внутренних сигналов.Это, возможно, неудивительно, учитывая, что прорастание является конечной реакцией, и поэтому для растения может быть выгодно иметь несколько входных данных, выстроенных в линию, прежде чем приступить к этому необратимому процессу. Например, некоторые гормоны, такие как GA, BR и этилен, могут способствовать прорастанию арабидопсиса, а мутации, влияющие на каждый из этих путей, снижают способность к прорастанию в присутствии экзогенной АБК (Steber et al. ., 1998; Beaudoin et al. ., 2000; Гассемиан и др. ., 2000; Стебер и Маккорт, 2001). Следовательно, сложность вывода может исказить специфичность генетического скрининга.

    Отсутствие специфичности при использовании прорастания для идентификации сигнальных компонентов ABA может быть частично преодолено за счет использования более специфических результатов, таких как экспрессия гормон-специфического гена. Однако альтернативным подходом является использование более сложной химии ABA. Существует ряд химических изомеров АБК, и, воспользовавшись дифференциальной реакцией на прорастание между двумя разными стереоизомерами АБК, были идентифицированы мутации в арабидопсисе, которые придают повышенную нечувствительность к одному изомеру по сравнению с другими. и другие (Nambara и др. ., 2002). Как и ожидалось, скрининг выявил старые нечувствительные к АБК гены, такие как ABI3 , ABI4 и ABI5 , но также обнаружил мутации потери функции в двух новых генах, обозначенных как CHO1 и CHO2 . Тот факт, что эти новые гены не были идентифицированы при насыщающем скрининге на нечувствительность к АБК, служит хорошим предзнаменованием для использования более сложной химии в качестве нового подхода к поиску мутаций в путях, которые могут придавать лишь тонкие фенотипы из-за генетической избыточности или могут играть лишь незначительную роль. в изучаемом процессе.

    Гиббереллины; чем больше, тем лучше

    ГА влияет на различные процессы, начиная от прорастания семян, роста листьев, удлинения стеблей, образования цветков и трихом и развития цветков и плодов. Используя генетические подходы, были идентифицированы два класса мутантов, отвечающих на GA, на основании их вегетативного фенотипа и ответа на GA (Harberd et al. ., 1998). В первую группу входят карликовые мутанты, нечувствительные к ГА, которые напоминают мутантов с дефицитом биосинтеза ГА.Эти мутации приводят к тому, что растения становятся низкорослыми, имеют темно-зеленые листья и демонстрируют дефекты в развитии цветков и сроках цветения, но, в отличие от ауксотрофов GA, эти мутанты не спасаются применением GA. У арабидопсиса первыми четко охарактеризованными ГА-ответными мутантами были полудоминантные мутации в гене, обозначенном GAI (Peng et al ., 1997). Рецессивные мутации в GAI придали растению в лучшем случае лишь тонкие фенотипы, предполагая, что этот ген был генетически избыточным.Это было подтверждено идентификацией рецессивных мутаций в гене RGA , которые частично восстановили фенотип GA биосинтетического мутанта GA (Silverstone et al ., 1997). Ген RGA , кодирующий фактор транскрипции, оказался гомологом GAI , а в геноме арабидопсиса недавно идентифицированы еще три гомолога GAI / RGA (Silverstone et al ., 1998; Ли и др. ., 2002; Вэнь и Чанг, 2002). Интересно, что мутации с потерей функции в двух из этих генов, RGL1 и RGL2 , как было показано, являются негативными регуляторами прорастания и могут играть другие роли в GA-зависимых процессах. На основе генетики этих исследований представляется, что члены семейства генов GAI/RGA/RGL1/RGL2 факторов транскрипции действуют как негативные регуляторы различных аспектов ГА-зависимых процессов, и что функция ГА заключается в ингибировании этих процессов. ингибиторы (рис.С; Harberd и др. ., 1998). В соответствии с этой идеей применение ГА, по-видимому, увеличивает оборот АРГ (Dill et al. ., 2001; Silverstone et al. ., 2001). Однако аналогичные эксперименты с RGL1 не показали GA-зависимого оборота, указывая на то, что хотя эти факторы транскрипции, по-видимому, имеют перекрывающиеся функции в отношении передачи сигналов GA, они могут регулироваться по-разному (Wen and Chang, 2002).

    Вторая группа ГА-ответных мутаций, по-видимому, придает растению независимый от ГА фенотип, и из них лучше всего охарактеризованы мутации в гене SPY (Jacobsen and Olszewski, 1993).Мутации потери функции в SPY имитируют растения дикого типа, обработанные GA, в том, что они демонстрируют тонкие удлиненные стебли и рано цветут. Поскольку мутации с потерей функции частично подавляют карликовый фенотип gai , формально этот ген действует генетически на уровне или ниже по течению от GAI (Peng et al ., 1997). Однако, поскольку SPY представляет собой O-связанную N -ацетилглюкозаминтрансферазу, она может влиять на передачу сигналов GA путем непосредственного гликозилирования GAI-подобных белков (Jacobsen et al ., 1996).

    Мутанты, отвечающие на GA, также были идентифицированы с использованием преимуществ антагонистических взаимодействий, возникающих между этим гормоном и АБК на уровне прорастания арабидопсиса. Скрининг для выявления мутаций, которые подавляют ABA-зависимое ингибирование прорастания, выявляет мутации потери функции в биосинтезе GA и восприятии GA, а неспособность ауксотрофов GA к прорастанию подавляется мутациями, которые снижают биосинтез ABA или реактивность (Koornneef et al ). ., 1982; Steber и др. , 1998). Более того, мутации spy также демонстрируют пониженную чувствительность к ABA на уровне прорастания (Steber et al. ., 1998). Упрощенно эти наблюдения предполагают, что регуляция реакции прорастания у арабидопсиса представляет собой баланс между действием АБК и ГК. Однако этот антагонизм не распространяется на другие аспекты функций, регулируемых ГА или АБК. Например, потеря биосинтеза АБК не противодействует ауксотрофным дефектам ГА, таким как снижение экспансии клеток, точно так же, как снижение уровней ГА не восстанавливает вилти фенотип ауксотрофа АБК.Еще раз становится очевидным, что взаимодействия гормонов часто связаны с развитием во времени и пространстве.

    ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

    Кто первый?

    Упомянутые выше тесты на повышение чувствительности к гормонам были разработаны для поиска генов, определяющих сигнальный путь гормонов, и с этой целью они оказались успешными. Например, мутации, которые первоначально были идентифицированы по измененному тройному ответу на этилен у арабидопсиса, выявили ETR1 , который, как впоследствии было показано, кодирует рецептор этилена (Schaller et al ., 1995). Однако специфичность мутантов, отвечающих за реакцию на этилен, несколько расходится с множеством физиологических исследований, показывающих, что изменения в одном гормоне могут проявляться изменениями в синтезе или реакции других гормонов. Некоторые из этих различий можно объяснить искусственностью применения гормонов, присущей физиологическим экспериментам. Однако некоторые из этих несоответствий также объясняются отсутствием подробного фенотипического анализа исходных гормональных мутантов, когда они были впервые идентифицированы.Например, мутации в ETR1 или других генах, отвечающих за этилен, также снижали чувствительность корней к экзогенной АБК (Beaudoin et al. ., 2000; Ghassemian et al. ., 2000). Более того, те же самые мутации, связанные с реакцией на этилен, повышают чувствительность семян к АБК. Таким образом, генетический анализ действия этилена и АБК предполагает, что эти гормоны противодействуют друг другу на уровне прорастания, действуют аддитивно в отношении роста корней, но, по-видимому, не взаимодействуют в таких процессах, как тройная реакция или закрытие устьиц (Hugouvieux et al. ., 2001).

    Мутации потери функции в гене EIN2 также были обнаружены в ходе скрининга с использованием ингибиторов транспорта ауксина или резистентности к применению цитокинина. В этом последнем случае нечувствительность к цитокинину мутантов ein2 возникает из-за того, что стадия, ограничивающая скорость синтеза этилена (ACC-синтаза), положительно регулируется цитокинином. Как следствие, многие дефекты роста, связанные с применением цитокинина, являются результатом перепроизводства этилена; следовательно, мутанты, нечувствительные к этилену, кажутся нечувствительными к экзогенному цитокинину (Vogel et al ., 1998). Хотя этот пример ясно демонстрирует, как добавление одного гормона может влиять на биосинтез другого, мутационный анализ действия этилена также предполагает, что специфические компоненты этого пути могут быть общими с другими сигнальными путями. Например, молекулярный анализ EIN2 показал, что этот белок имеет независимые сигнальные домены этилена и жасмоновой кислоты (Alonso et al. , 1999). Из-за их биохимической природы нетрудно представить, как неразборчивые сигнальные компоненты могут иметь несколько мишеней на разных сигнальных путях, так что определенные компоненты могут действовать как узлы для передачи информации между различными путями.Однако, в отличие от синтеза гормонов, который может влиять на другие пути неклеточно автономно, узлы сигнальных компонентов могут взаимодействовать только клеточно-автономно.

    Из приведенных выше примеров видно, что гормоны могут взаимодействовать на нескольких уровнях, от влияния на синтез друг друга до обмена сигнальными компонентами для создания узлов взаимодействия. Кроме того, эти взаимосвязи имеют контекст развития, что означает, что взаимодействия имеют как временные, так и пространственные паттерны.Учитывая эту информацию, возникает один интригующий вопрос: как развивались все эти перекрестные помехи. Были ли отдельные сигнальные пути гормонов, которые каким-то образом достигали общих компонентов? Возможно ли, чтобы один гормонозависимый путь находился под влиянием второго гормона, если первый путь улавливает белковый мотив, на который влияет второй гормон? Например, недавний молекулярно-генетический анализ ответа на ауксин у арабидопсиса позволяет предположить, что этот гормон действует путем модулирования специфических генов, регулируемых IAA, путем убиквитинирования набора короткоживущих репрессоров, называемых белками AUX/IAA (рис.; обзоры см. в Hellmann and Estelle, 2002 и Kepinski and Leyser, 2002). Убиквитинирование белков AUX/IAA зависит от белка F-box, который связывается с комплексом SCF (для SKP1, Cullin/CDC53, белок F-box). Специфичность системы определяется белками F-box, и эти белки в настоящее время вовлечены в морфогенез цветков, фотоконтроль циркадных часов и старение листьев, что подразумевает широкий спектр функций пути SCF в развитии растений (Ingram et al. , 1997; Ян и др. ., 1999; Somers и др. ., 2000; Дитерле и др. ., 2001; Woo и др. ., 2001). Что еще более важно, оба гена COI1 и SLY1 кодируют белки F-box, что свидетельствует о том, что SCF-зависимый оборот белков необходим для правильной передачи сигналов в путях жасмоната и GA (Xie et al. ., 1998; C.M. Steber, pers. комм.). Хотя кажется, что белки F-box определяют специфичность, недавнее сообщение о том, что мутации в гене AXR1 , который первоначально был идентифицирован как ген ответа на ауксин, дают растения, которые также нечувствительны к жасмонату, демонстрирует, как этот убиквитинирующий комплекс может действовать как узел взаимодействия двух гормональных путей (рис.; Тиряки и Стасвик, 2002). Из этого примера нетрудно понять, как уже существующий путь развития мог бы в ходе эволюции приобрести белковый компонент, чувствительный к убиквитинированию. Попав под контроль комплекса SCF, возможно, что путь развития может стать косвенно связанным с передачей сигналов ауксина, жасмоната и GA. В связи с этим ряд мутаций, повышающих чувствительность к ABA, дефектен в процессинге РНК. Это говорит о том, что ABA может также регулировать уровень специфических белков, регулируя стабильность РНК (Hugouvieux et al ., 2001). Следовательно, если гормоны контролируют время жизни специфических сигнальных белков, они могут, в принципе, координировать разрозненные сигнальные пути, чтобы координировать общее развитие растений.

    Рис. 2. Гормональная сигнализация может регулироваться оборотом сигнальных компонентов. Комплекс SCF состоит из четырех субъединиц (CUL1, ASK1, RBX1 и белка F-box). Кулин (CUL1) требует модификации RUB, опосредованной AXR1-ECR1, для нормальной активности комплекса. Взаимодействуя со специфическими субстратами, белки F-box придают специфичность механизму деградации.Мутации с потерей функции в генах, кодирующих белки F-бокса TIR1, COI1 и SLY1, вызывают нарушение чувствительности только к одному гормону, в данном случае к ауксину, JA и GA соответственно. Напротив, мутации в гене ARX1 , который кодирует активирующий фермент комплекса RUB, влияют на различные гормональные ответы, такие как ауксин, ЖАК и АБК. В показанном примере белки AUX/IAA связываются с белком F-box TIR1, что позволяет им убиквитинироваться комплексом SCF. Это нацелено на белки AUX / IAA для деградации.Удаление этих белков позволяет димеризировать факторы транскрипции ARF, обеспечивая транскрипцию генов ответа на ауксин. Передача сигналов JA следует аналогичному механизму, за исключением того, что белок F-box представляет собой COI1.

    Что на втором?

    Если гормоны могут кооптировать уже существующий путь, можно было бы ожидать, что генетические скрининги, первоначально разработанные для идентификации генов в гормононезависимых процессах, могут также идентифицировать гены в передаче сигналов гормонов. Нигде это не было так очевидно, как в генетических скринингах, предназначенных для выявления мутаций, влияющих на передачу сигналов сахара.Предпосылка этих скринингов состояла в том, чтобы идентифицировать мутанты, которые были способны прорастать и расти на средах, содержащих концентрации сахара, которые обычно ингибируют рост и развитие проростков дикого типа. Удивительно, но большинство идентифицированных мутаций были новыми аллелями известных ABA-биосинтетических генов, мутациями в подмножестве локусов ABA-ответа и мутациями в генах, участвующих в ответе на этилен (для обзора см. Gibson, 2000). Интересно, что не все мутанты, реагирующие на сахар, находятся в одном гормональном пути, и не все гены, идентифицированные в одном гормональном пути, являются мутантами, реагирующими на сахар.Например, только мутации в ABI4 и ABI5 вызывают измененную реакцию сахара у арабидопсиса. Если уровень чувствительности к сахару определяется через сигнальный путь АБК, почему скрининг также не выявляет мутации в ABI1 , ABI2 и ABI3 ? В соответствии с этим эксперименты по реконструкции с известными мутациями в этих генах не приводили к изменению ответа на сахар. Однако эти эксперименты по реконструкции были ограничены использованием отдельных мутантных аллелей для каждого из этих генов.Совсем недавно, используя большую коллекцию мутантов abi3 , было показано, что некоторые аллели действительно придают измененную чувствительность к глюкозе (Nambara et al. ., 2002). Таким образом, роль ABI3 во взаимодействии сахар-АБК, по-видимому, является аллель-специфичной, и следует проявлять осторожность при размещении гена вне конкретной функции, основанной исключительно на одиночных аллелях.

    Причина того, что у АБК-биосинтетических мутантов и некоторых АБК-нечувствительных мутантов наблюдается измененная реакция на сахар, в настоящее время неясна, и более озадачивающим является наблюдение, что ингибирующий эффект высоких уровней сахара ограничивается прибл.2 дня после прорастания арабидопсиса. Опять же, это демонстрирует важность контекста развития в определении чувствительности тканей. Этот случай свидетельствует о том, что после прорастания появляется чувствительное к сахару окно развития, которое требует ABA (Gibson, 2000). После того, как проросток становится фотосинтетически компетентным, возможно, что чувствительность к АБК снижается, что приводит к нечувствительности проростка к синтезу АБК, индуцированному сахаром. Интересно, что исследования экспрессии ABI5 предполагают, что этот фактор транскрипции функционирует в коротком периоде развития после прорастания (Lopez-Molina et al ., 2001). Эти временные рамки могут установить стадию, на которой проростки арабидопсиса чувствительны к высоким концентрациям сахара.

    На раннюю чувствительность проростков к сахару также может влиять этилен, поскольку мутанты, которые перепроизводят этилен, и мутанты, сигнализирующие о конститутивном этилене, нечувствительны к высоким концентрациям глюкозы, тогда как мутанты, нечувствительные к этилену, гиперчувствительны к глюкозе (Zhou et al. ., 1998; Gibson). и др. ., 2001). Эти результаты свидетельствуют о том, что повышенное действие этилена снижает чувствительность молодых проростков к глюкозе.Более того, данные о том, что эффекты этилена на реакцию сахара требуют синтеза АБК, указывают на то, что АБК функционирует на пути передачи сигналов этилена или ниже него во время раннего развития проростков (Zhou et al. ., 1998). Мутации, которые снижают передачу сигналов этилена, могут повышать уровень АБК в прорастающих семенах, тем самым подавляя последующий рост проростков. В этом сценарии высокие уровни сахара могут сигнализировать через этиленовый путь, регулирующий биосинтез АБК. В качестве альтернативы, индуцированный сахаром синтез или чувствительность АБК могут быть нейтрализованы действием этилена.В любом случае, эти взаимодействия между передачей сигналов гормонов и первичным метаболизмом предполагают, что в будущем может быть трудно установить иерархию контроля над сигнальными путями у растений.

    БУДУЩИЕ ПЕРСПЕКТИВЫ

    Подход, заключающийся в проведении физиологических анализов, на которые влияет определенный гормон, и выделении мутантов, которые не реагируют должным образом, привел к идентификации генов, необходимых для действия гормонов. Однако тщательное фенотипическое исследование этих мутантов также выявило сложность гормонального действия и трудность создания простых линейных путей входа и выхода.Возможно, эта неспособность отобразить гормональные пути в двухмерном пространстве диаграммы является отражением сложности четырехмерного пространства и времени, в которых обитает клетка. Таким образом, изображение путей со стрелками и иерархии, показанное в этом обзоре, может быть концептуально ограничивающим. Альтернативным и менее механистическим представлением взаимодействий гормонов была бы диаграмма пути, основанная только на генетических взаимодействиях в отсутствие иерархии. Например, с использованием супрессорного и энхансерного анализа мутантов era1 и abi1 в качестве отправной точки показаны новые закономерности между гормональными путями (рис.). Супрессоры эра1 идентифицируют ожидаемые нижележащие гены ABA-ответа, такие как ABI3 и ABI5 , а также компонент трансдукции GA-сигнала SPY1 . Энхансеры abi1 идентифицируют нижележащие факторы транскрипции ABI ( ABI3 , ABI4 и ABI5 ) и мутации в CTR1 , который участвует в действии этилена. Кроме того, супрессоры abi1 идентифицируют генетические взаимодействия с генами ответа на ABA ( ERA1 ), генами ответа на этилен ( EIN2 ) и генами, участвующими в передаче сигналов GA ( SLY1 ).Эта карта генетического взаимодействия представляет гормональную сигнализацию как более похожую на паутину узлов и линий. Интересно, что общее колебание паутины важнее для паука, чем функция любого отдельного узла, поскольку все узлы работают в унисон, чтобы обеспечить правильное колебание. Вполне возможно, что общее колебание, вызванное активностью или неактивностью генов из-за гормональных сигналов, может определять, прорастет семя арабидопсиса или нет, и что эта информация распространяется по сети многими различными путями.В будущем сравнение карт генетических взаимодействий с паттернами, основанными на профилировании транскриптов и других технологиях геномики, может позволить получить более четкое представление о взаимодействиях гормонов внутри клетки.

    Рис. 3. Передача сигналов гормонами, как описано генетическим взаимодействием. Используя в качестве отправной точки сенсибилизированные генетические фоны era1 (повышенная чувствительность к АБК) и abi1 (сниженная чувствительность к АБК), были идентифицированы мутации супрессора и энхансера второго сайта.Линии соединяют мутации второго сайта с исходной мутацией, которая подавлялась или усиливалась. В скрининге использовали прорастание семян в качестве анализа чувствительности к АБК. Синие молекулы представляют известные гены ответа на АБК, зеленые молекулы представляют известные гены ответа на ГА, а желтые молекулы представляют известные гены ответа на этилен.

    Управление сайт-направленным редактированием РНК с помощью химически индуцированной димеризации

    Abstract

    Различные подходы к нацеливанию РНК были разработаны для изменения конкретных сайтов в эндогенных транскриптах, открывая новые возможности для множества основных исследовательских инструментов и многообещающих клинических приложений в будущем. .Здесь мы комбинируем сайт-направленное редактирование аденозин-инозиновой РНК с химически индуцированной димеризацией. В частности, мы достигаем строгого и дозозависимого контроля реакции редактирования с гибберелловой кислотой и получаем выходы редактирования до 20% и 44% в эндогенных транскриптах STAT1 и GAPDH в клеточной культуре. Кроме того, релевантная для заболевания мутация MECP2 R106Q была репарирована с выходом редактирования до 42 %. Представленный принцип позволит новые приложения, где желателен временной или пространственно-временной контроль над механизмом нацеливания РНК.

    Ключевые слова: ADAR, химически индуцированная димеризация, гибберелловая кислота, нацеливание на РНК, сайт-направленное редактирование РНК

    Abstract

    редактирование РНК растительный гормон гибберелловая кислота, применяя механизм химически индуцированной димеризации. Жесткий контроль и редактирование дают до 44 % результатов, достигаемых на эндогенных мишенях в культуре клеток человека.

    Редактирование оснований РНК позволяет переписывать генетическую информацию с высокой эффективностью и без риска необратимых нецелевых эффектов и, таким образом, имеет большие перспективы для клинического применения. [1] Кроме того, обратимость события редактирования временной копии (м)РНК позволяет настраивать выход замены оснований и может использоваться для внезапного и/или временного введения летальных мутаций. [2] Подход SNAP-ADAR был разработан для сайт-направленного редактирования РНК аденозин-в-инозин (A-to-I). [3] Для этого домены связывания дцРНК, ответственные за распознавание субстрата в аденозиндезаминазе дикого типа, действующей на РНК (ADAR) [4] , заменены на самомаркирующуюся SNAP-метку.SNAP-метка ковалентно связывается с направляющими РНК, несущими свой субстрат, O 6 бензилгуанин [5] (BG, snap-guideRNAs), что затем позволяет привлекать слитый домен дезаминазы ADAR к конкретной мишени посредством спаривания оснований Уотсона-Крика. Было показано, что этот подход является рационально программируемым для достижения высоких результатов редактирования в культуре клеток и in vivo, [6] , если быть очень точным, [2] , и достаточно эффективным, чтобы обеспечить параллельное редактирование. [6] Желательно расширение подхода за счет дополнительных уровней контроля. Недавно мы достигли фотоконтроля в развивающихся эмбрионах путем применения направляющих РНК, несущих нитропиперонилоксиметил-защищенный фрагмент BG. [7] Здесь мы теперь включаем контроль реакции редактирования с помощью химически индуцированной димеризации [8] с малой молекулой. Это открывает множество новых возможностей для редактирования с временным, пространственным или дозовым контролем.

    В частности, мы решили использовать гибберелловую кислоту (GA 3 ) для химически индуцированной димеризации.GA 3 представляет собой растительный гормон, который может доставляться в виде проникающего в клетку пролекарства (GA 3 −AM), который, как было показано, индуцирует гетеродимеризацию двух растительных белков GAI (нечувствительный к гибберелловой кислоте) и GID1A (гиббереллин нечувствительный карлик 1А, рисунок  ) на временной шкале от секунд до минут внутри живых клеток. [9] Связывание GA 3 с GID1A индуцирует конформационные изменения, которые приводят к рекрутированию GAI. Чтобы контролировать реакцию редактирования на основе SNAP-ADAR с помощью GA 3 -индуцированной димеризации, SNAP-метка и домен деаминазы ADAR нуждались в разработке двух отдельных белков слияния с GAI и GID1A, соответственно.Мы решили использовать слияние GAI 1–92 -ADAR1, применяя 92-аминокислотный фрагмент GAI, достаточный для димеризации, [9] и слияние SNAP-GID1A. В нашем дизайне мы сохранили SNAP-метку и домен дезаминазы ADAR в соответствующих N- и C-концевых позициях. Мы объединили домен дезаминазы ADAR с фрагментом GAI, чтобы также расположить последний в соответствии с его нативным N-концевым положением. Недавно был применен белок GID1A в сочетании с N-концевой меткой eGFP. [ 9 , 10 ]. растительного белка.Наконец, оба трансгена имеют одинаковый размер (59 кДа). Мы сконструировали четыре плазмидные конструкции ( I IV ), содержащие оба трансгена в одной экспрессионной кассете (рис. а). Этот дизайн был выбран для получения сбалансированной экспрессии обоих трансгенов после стабильной генетической интеграции соответствующей одиночной плазмиды в клеточную линию. Кроме того, в условиях транзиторной экспрессии такие конструкции могли бы помочь снизить смещение трансфекции и улучшить баланс экспрессии обоих трансгенов.Два трансгена либо вводили последовательно, каждый со своим промотором CMV и терминатором bGH, либо экспрессировали как единую конструкцию P2A [11] из одного промотора с использованием механизма пропуска трансляции для создания двух отдельных белков из одного транскрипта в почти 1 : 1 стехиометрия. Для слияния эдитазы мы выбрали либо каталитический домен дезаминазы человеческого ADAR1 дикого типа (GAI 1–92 -ADAR1), либо гиперактивного мутанта (GAI 1–92 -ADAR1Q), несущего хорошо известную E>Q единичная точечная мутация. [12] Для создания дуоклеточных линий, стабильно экспрессирующих оба трансгена при индукции доксициклином, мы применили систему 293 Flp-In T-REx. Для каждой конструкции, I IV , мы создали отдельную дуэтную клеточную линию, 1 4 , с помощью плазмидной трансфекции и процедуры отбора антибиотиков, как описано выше. [6] Доксициклин-зависимая экспрессия обоих трансгенов была подтверждена вестерн-блоттингом с антителами против деаминазы ADAR1 (рис.  b) и SNAP-tag (рис.  c).Примечательно, что уровни экспрессии были сравнительно низкими по сравнению со стабильной экспрессией SNAP-ADAR1Q после интеграции в клеточную линию 293 Flp-In T-REx (рис.  b, c). [6]

    Принцип индуцированного гибберелловой кислотой сайт-направленного редактирования РНК с помощью платформы SNAP-ADAR. Ковалентное сопряжение O 6 Модифицированная бензилгуанозином (BG) направляющая РНК (snap-guideRNA) с SNAP-меченной дезаминазой ADAR позволяет направлять активность A-to-I дезаминазы на любую произвольную мРНК для достижения программируемого, управляемого РНК сайт-специфического редактирования РНК .Чтобы поставить процесс под контроль гибберелловой кислоты, белок SNAP-ADAR расщепляется на GAI 1-92 -ADAR и слияние SNAP-GID1A, отделяя активность редактирования от механизма нацеливания РНК. Гибберелловая кислота, доставляемая в виде проницаемого для клеток ацетоксиметилового эфира (GA 3 −AM), усиливает гетеродимеризацию GAI 1–92 и GID1A путем связывания с последним и, таким образом, привлекает дезаминазу ADAR к направляющей РНК/ Дуплекс субстрата мРНК.

    Экспрессионные конструкции для индуцированного гибберелловой кислотой редактирования РНК с помощью SNAP-ADAR и анализа экспрессии трансгена.а) Конструкции I IV были разработаны для создания трансгенных 293 клеточных линий Flp-In T-REx 1 4 , стабильно коэкспрессирующих GAI 1–92 -ADAR1(Q) и SNAP- GID1A из одной кассеты под контролем доксициклина. TetO 2 : оператор tet, приводит к подавлению экспрессии в отсутствие тетрациклина; [13] bGH: терминатор бычьего гормона роста; P2A: свиной тешовирус-1, саморасщепляющийся пептид 2A. [11] Протокол получения стабильных клеточных линий 1 4 из конструкций I IV и подробные сведения о конструкциях можно найти во вспомогательной информации.b) Характеристика экспрессии GAI 1–92 -ADAR1(Q) с помощью вестерн-блоттинга (домен дезаминазы α-ADAR1). Клетки 293T дикого типа временно трансфицировали конструкциями I IV , а стабильные клеточные линии 3 и 4 исследовали без (-Dox) и с 24 ч (+Dox) индукции доксициклином. Для сравнения показана ранее установленная клеточная линия SA1Q 293 Flp-In T-REx ( SA ). c) То же, что и (b), но для анализа экспрессии SNAP-GID1A (α-SNAP-метка).

    Сначала мы протестировали реакцию редактирования в клеточных линиях 3 и 4 , экспрессирующих гиперактивный гибрид ADAR1Q. В частности, мы нацелились на кодон 5′-UAG в 3′-нетранслируемой области (UTR) эндогенного транскрипта GAPDH (рис.  a). Помимо направляющей РНК snap-GAPDH, несущей фрагмент BG, необходимый для ковалентной реакции с SNAP-меткой, мы также применили направляющую РНК NH 2 -GAPDH в качестве контроля, состоящую из той же последовательности и модели модификации, но без фрагмента BG, таким образом, неспособен к образованию конъюгата.Контрольная направляющая РНК (NH 2 -GAPDH) не давала заметного редактирования, что подчеркивает необходимость ковалентного присоединения направляющей РНК для рекрутирования активности дезаминазы ADAR. Этот чистый отрицательный контроль является отличительной чертой нацеливания РНК с подходом SNAP-ADAR [ 2 , 6 ]. для точного обнаружения (5 %) была обнаружена направляющая РНК snap-GAPDH. Однако при наличии в среде 10 мкм GA 3 -AM в клеточной линии 3 и 4 были достигнуты уровни редактирования 29 ± 9 % и 44 ± 4 % соответственно.Поэтому мы оцениваем динамическое изменение выхода редактирования с помощью индукции GA 3 -AM более чем в 10  раз. Тем не менее, эффективность редактирования оставалась явно ниже, чем у аналогичной клеточной линии SNAP-ADAR1Q, [6] , которая, как и ожидалось, обеспечивала высокое редактирование независимо от GA 3 −AM (74±3 % против 76±3%). %, рисунок а). Эта потеря эффективности может быть связана либо с низкой экспрессией слитых белков GAI и GID1A по сравнению со слитым SNAP-ADAR1Q (рис.  b, c), либо с недостатком, возникающим из-за необходимости привносить не только один, но два белка, направляющая РНК и мРНК вместе для редактирования.Чтобы убедиться, что нанесенное количество GA 3 -AM было достаточным для индукции максимального редактирования, мы определили дозозависимую реакцию выхода редактирования в клеточной линии 4 в диапазоне концентраций от 10 нм до 100 мкм GA 3 −AM (рисунок b). Мы определили EC 50 примерно до 290 нм, что указывает на то, что выход редактирования уже был близок к насыщению при 10 мкм GA 3 -AM. Определенное значение EC 50 соответствует более ранним сообщениям из различных приложений в литературе. [9]

    Контроль сайт-направленного редактирования РНК с помощью гибберелловой кислоты. а) направляющую РНК snap-GAPDH (5,0  пмоль), нацеленную на кодон 5′-UAG в 3′-UTR эндогенной GAPDH, трансфицировали в клеточные линии 3 и 4 , как указано. NH 2 -guideRNA, в которой отсутствует часть BG, необходимая для ковалентной конъюгации со слиянием SNAP-GID1A, служила в качестве отрицательного контроля. Одновременно в среду добавляли GA 3 -AM (10  мкм), как указано. Выходы редактирования РНК определяли через 24 часа после трансфекции с помощью ОТ-ПЦР и секвенирования по Сэнгеру, как описано во вспомогательной информации.Редактирование явно зависело от GA 3 −AM. b) Определение реакции на дозу GA 3 -AM, влияющей на выход редактирования РНК в клеточной линии 4 . Редактирование проводили, как описано на панели а) на эндогенном GAPDH, но с концентрациями GA 3 -AM в диапазоне от 10 нм до 100 мкм. EC 50 был определен как 290 нм путем применения логистической подгонки. в) Аналогично панели а), но с (щелчком) 2 -STAT1 направляющая РНК (5,0 пмоль), нацеленная на сайт фосфорилирования Tyr(Y)701 (кодон 5′-UAU) в эндогенном транскрипте STAT1 в клеточных линиях 3 и 4 , индуцированные 100  мкм GA 3 -AM, как указано.г) Редактирование Y701 в эндогенном STAT1 в клетках 293T дикого типа и при транзиторной плазмидной трансфекции экспрессионных кассет I IV (300 нг/лунка). Клетки обрабатывали GA 3 -AM и направляющими РНК в указанных концентрациях и количествах. e) Репарация временно трансфицированных плазмидой MECP2 R106Q в клетках дикого типа 293T  при временной плазмидной трансфекции экспрессионной кассеты III или IV с помощью направляющей РНК 2 -MECP2 (1.0 пмоль), нацеленный на мутацию R106Q, связанную с заболеванием, индуцированную 10 мкМ или 100 мкМ GA 3 -AM, как указано. На панели (а)–(д) данные показаны как среднее значение ± стандартное отклонение. из N=3 независимых экспериментов.

    В прошлом мы обнаружили, что редактирование РНК A-to-I в открытой рамке считывания (ORF) значительно сложнее, чем редактирование в 3′-UTR. [6] Таким образом, мы проверили редактирование ORF эндогенного транскрипта STAT1 (рис. c). В частности, мы разработали направляющую РНК, нацеленную на сайт фосфорилирования Tyr(Y)701 (кодон 5′-UAU), который важен для активации указанного транскрипционного фактора при передаче сигналов интерферона. [14] Опять же, мы не обнаружили заметного редактирования с помощью NH 2 -guideRNA, в которой отсутствует самомаркирующаяся часть. Тем не менее, мы получили разумные уровни редактирования при применении направляющей РНК (snap) 2 –STAT1, способной рекрутировать два белка SNAP-GID1A на направляющую РНК. В присутствии 100 мкм GA 3 -AM уровни редактирования 11 ± 3 % и 20 ± 6 % были достигнуты в клеточной линии 3 и 4 соответственно. Опять же, клеточная линия 4 превзошла клеточную линию 3 посредством редактирования выхода.Из-за отсутствия обнаруживаемого редактирования в отсутствие GA 3 -AM динамический диапазон для индукции с GA 3 -AM снова был оценен как очень высокий. Однако общий выход редактирования был умеренным по сравнению с уровнями, полученными в аналогичной клеточной линии SNAP-ADAR1Q 293 Flp-In T-REx (79 ± 2 % и 84 ± 3 %, без по сравнению с GA 3 -AM, рисунок  c). ). [6] Мы задались вопросом, было ли это связано с низкими уровнями экспрессии слитых белков GAI и GID1A и могло ли редактирование способствовать более сильной экспрессии слитых белков и дальнейшей оптимизации условий.Таким образом, мы протестировали редактирование всех четырех конструкций при временной трансфекции в клетки 293T  дикого типа и варьировали количество направляющей РНК 2 –STAT1 (0,5 пмоль против 5,0 пмоль) и индуктора (10 мкм против 100 мкм, рис. г). Мы сделали несколько наблюдений. Во-первых, мы обнаружили, что конструкции дикого типа I и II дают значительно меньше редактирования, чем гиперактивные конструкции III и IV . Это соответствует литературным данным для аналогичных клеток SNAP-ADAR1 293 Flp-In T-REx. [6] Во-вторых, редактирование работало лучше с большим количеством направляющей РНК. В-третьих, большее количество индуктора также способствовало редактированию. Подобно тому, что мы наблюдали для клеточной линии 4 по сравнению с клеточной линией 3 , конструкция IV давала лучшие результаты редактирования, чем конструкция III в большинстве условий. В совокупности данные свидетельствуют о том, что выход редактирования увеличивается за счет каждого компонента, который помогает в формировании третичного комплекса (направляющая РНК + мРНК + два белка), например, большее количество направляющей РНК, большее количество индуктора и более высокая экспрессия белка.Последнее было подтверждено вестерн-блоттингом (рис.  b), показывающим, что конструкция IV экспрессировала больше GAI 1–92 -ADAR1Q, чем конструкция III . Примечательно, что выходы редактирования эндогенного STAT1 при временной экспрессии трансгена едва ли превышали уровни, полученные в стабильных клеточных линиях (рис. c, d). Очевидно, что сбалансированная экспрессия трансгена в стабильных клеточных линиях, даже при очень низких уровнях экспрессии, более эффективна для нацеливания на эндогенные транскрипты, чем сильная, но неравномерная экспрессия трансгена при плазмидной трансфекции.

    Наконец, мы стремились исправить мутацию R106Q в факторе транскрипции Methyl CpG Binding Protein 2 (MECP2), которая, как известно, вызывает синдром Ретта. Лежащая в основе мутация G-to-A расположена в ДНК-связывающем домене MECP2 и приводит к снижению стабильности белка и, следовательно, снижению уровней экспрессии, а также снижению связывания с гетерохроматином. [15] Поскольку здоровые уровни экспрессии MECP2 различаются между различными типами нервных клеток [16] и дупликация MECP2 вызывает синдром дупликации MECP2, [17] репарация R106Q под строгим, точно дозируемым контролем на уровне транскрипта очень желательно.Таким образом, мы трансфицировали клетки 293T  дикого типа с помощью MECP2 R106Q и конструкции III или IV и протестировали направляющую РНК, нацеленную на сайт R106Q. При индукции 10 мкм или 100 мкм GA 3 −AM мы достигли хороших результатов редактирования как для конструкции III (30±3 % и 30±2 % соответственно), так и для конструкции IV (40±5 % и 42±5 % соответственно, рис. д). В отличие от редактирования в транскрипте STAT1 (рисунок  d), выходы редактирования для MECP2 в присутствии 10 мкМ и 100 мкМ GA 3 -AM были одинаковыми, что указывает на насыщение при 10 мкМ индуктора для этой мишени, что хорошо соответствует кривая зависимости от дозы показана для мишени GAPDH (рис.  b).И снова конструкция IV показала лучшие результаты, чем конструкция III . Примечательно, что уровни редактирования MECP2 наших конструкций были близки к уровням редактирования с трансфицированной конструкцией SNAP-ADAR1Q (57±3 %, 61±7 % и 60±5 % без, с 10  мкм и с 100  мкм GA 3 −АМ соответственно). Важно отметить, что выходы редактирования, полученные с конструкцией IV , находятся в диапазоне выходов редактирования, достаточных для значительного обогащения гетерохроматиновых MECP2 (37–52%) in vivo в нервных клетках мышей [18] с помощью системы λN-ADAR2Q. [19] и, следовательно, может привести к значительному уменьшению фенотипа синдрома Ретта.

    Таким образом, мы добились строгого контроля над сайт-направленным редактированием РНК путем химически индуцированной димеризации с использованием низкомолекулярных растительных гормонов. Димеризация происходит быстро (от секунд до минут) после добавления индуктора [9] и вызывает настраиваемый дозозависимый ответ. Этот временной и дозозависимый контроль реакции редактирования РНК может открыть новые возможности для привлекательных приложений, например, для запуска целенаправленного редактирования во время эмбриогенеза после микроинъекции всех компонентов, [7] для запуска редактирования для измерения времени жизни РНК с отметкой времени РНК приближается более точно, [20] или модулировать фармакологический (неблагоприятный) эффект целенаправленного редактирования. [21] Важно отметить, что мы продемонстрировали, что наша сконструированная система, основанная на подходе SNAP-ADAR в сочетании с гетеродимеризацией GID1A-GAI, индуцированной гибберелловой кислотой, работает не только за счет временной сверхэкспрессии, но и при стабильной генетической интеграции компонентов, что, как мы показали ранее, уменьшает артефакты [22] и глобальное нецелевое редактирование. [ 2 , 6 ] в отсутствие гибберелловой кислоты.Несмотря на то, что для создания контроля малых молекул требовалось расщепление фермента редактирования SNAP-ADAR на два отдельных слитых белка, редактирование эндогенных транскриптов с низкой экспрессией было возможно с разумными выходами, как показано для редактирования функционально важного сайта фосфорилирования Y701 в STAT1. . Это еще более примечательно, учитывая сравнительно низкие уровни экспрессии сконструированных компонентов. Мы предполагаем, что метод нацеливания РНК SNAP-ADAR особенно подходит для разработки такого рода контроля малых молекул, поскольку ковалентная конъюгация направляющей РНК и SNAP-метки обеспечивает перманентную предварительную организацию двух компонентов, тем самым уменьшая количество компонентов, которые необходимы. встретить для редактирования.Кроме того, релевантная для заболевания мутация R106Q в MECP2 может быть восстановлена ​​до такой степени, что, как сообщалось, [18] значительно усилит функцию MECP2. Мы ожидаем, что этот подход может быть дополнительно улучшен, например, выходы редактирования могут быть усилены за счет оптимизации уровней экспрессии слитых белков. Кроме того, подход может быть расширен за счет одно- или двухфотонного расщепления гибберелловой кислоты [10] , чтобы обеспечить пространственно-временной контроль в будущем. в дополнительные инструменты, которые применяют РНК-управляемые белки для управления (эпи)транскриптомом [24] или могут быть интегрированы в существующие датчики на основе SNAP-тегов [25] , чтобы включить дополнительный уровень контроля.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.