Мех коробка: Механическая коробка переключения передач (МКПП): особенности и специфика устройства

Содержание

Механическая коробка переключения передач (МКПП): особенности и специфика устройства

Механическая коробка передач – один из важнейших узлов автомобиля, ее главная задача состоит в приеме, изменении и передаче крутящего момента от мотора на колеса. Если говорить простыми словами, она позволяет колесам авто вращаться с различной скоростью при одних и тех же оборотах двигателя.

У многих автомобилистов может возникнуть резонный вопрос, а для чего все-таки нужен этот механизм? Ведь скорость авто зависит от силы нажатия на акселератор, и, казалось бы, можно соединить мотор прямо с колесами. Но двигательные агрегаты работают в диапазоне 800-8000 оборотов в минуту. А при движении – в еще более узком диапазоне 1500-4000 об/мин. При слишком долгой работе на низких оборотах (менее 1500) двигатель быстро утратит работоспособность, поскольку давление масла будет недостаточным для смазки. А длительная работа на слишком высоких оборотах (свыше 4000) становится причиной быстрого износа комплектующих.

Рассмотрим, как коробка передач изменяет скорость авто:

  • двигатель в процессе работы вращает коленвал и приводной вал;
  • это движение передается на шестерни МКПП
  • шестерни начинают вращаться с разной скоростью;
  • водитель включает выбранную передачу;
  • на вал кардана и колеса передается заданная скорость вращения;
  • авто начинает ехать с требуемой скоростью.

Иными словами, коробка перемены передач призвана обеспечить выбор подходящего режима функциональности мотора в разных условиях на дороге — разгон, торможение, плавная езда и прочее. В «механике» процедура смены передач производится водителем в ручном режиме, без использования вспомогательных приспособлений.

Специфика работы МКПП

Возможности каждой машины с МКПП зависят от передаточного числа, т.е. от того, какое количество передач доступно для регулирования скоростных режимов транспортного средства.

Современные авто обычно комплектуются пятиступенчатыми МКПП.

Механические коробки передач производятся уже свыше 100 лет, сегодня их конструкция доведена практически до идеала. Они надежны, экономичны в обслуживании, неприхотливы в эксплуатации и легко ремонтируются. Пожалуй, единственный их минус – необходимость самостоятельно переключать передачи.

Коробка переключения передач тесно взаимодействует со сцеплением. При смене передачи водитель должен выжимать педаль сцепления, чтобы синхронизировать работу двигателя и валов, регулирующих повышение/понижение скорости.

Когда водитель выжимает сцепление и начинает переключать передачу, начинают работать вилки переключения передач, которые перемещают муфты в нужном для переключения направлении. При этом сразу же срабатывает замок (блокировка), который исключает возможность одновременного включения сразу двух передач. Если бы устройство не было оборудовано замком, то периодически вилки переключения передач могли бы цеплять сразу две муфты.

После того, как вилка задела муфту, она передает ей необходимое направление. Зубцы муфты и размещенной рядом на валу шестерни передачи соприкасаются, из-за чего шестерня блокируется. После этого сразу же начинается совместное синхронизированное вращение на валу, МКПП передает это вращение в двигательный агрегат, от него — на карданный вал и далее — на сами колеса. Вся эта процедура занимает долю секунды.

В том же случае, если ни одна из шлицевых муфт не входит во взаимодействие с шестерней (т.е. не блокирует ее), то коробка находится в нейтральном состоянии. Соответственно, движение вперед невозможно, так как силовой агрегат и трансмиссия находятся в разобщенном состоянии.

Механическая коробка переключения передач обычно оборудована удобным для руки рычагом, который специалисты называют «селектором». Выжимая рычаг в определенном направлении, водитель выбирает повышение или понижение скорости. Традиционно селектор переключения передач устанавливается на самой коробке в салоне автомобилей, либо же сбоку.

Преимущества использования МКПП в России

Самым главным достоинством автомобилей с МКПП можно считать их стоимость, кроме того, «механика» не требует специального охлаждения, которым обычно оборудуются АКПП.

Каждый опытный водитель хорошо знает, что авто с МКПП более экономичны в потреблении топлива. Например, Peugeot 208 Active 1.6 бензин, механика (115 л.с), который имеется в наличии в ГК Favorit Motors, потребляет всего 5.2 литра горючего на 100 километров пути в городских условиях. Подобно этой марке, и другие модели транспортных средств с МКПП на сегодняшний день являются востребованными теми водителями, которые хотят экономить средства на покупку горючего без ущерба для режима эксплуатации автомобиля.

МКПП имеет простую конструкцию, благодаря чему диагностика неполадок может быть проведена без использования дорогостоящего оборудования. Да и сам ремонт потребует значительно меньших вложений от собственника автомобиля, чем в случае устранения неисправностей в коробке-автомат.

Еще одно достоинство «механики» — надежность и долговечность. Срок службы механической коробки передач обычно приравнивается к сроку службы самого автомобиля. Высокая надежность коробки становится одной из основных причин, почему автолюбители выбирают машины с МКПП. Однако специфика переключения передач потребует относительно частой замены механизмов сцепления, однако это не является слишком затратной процедурой.

В экстренных ситуациях на дороге у авто с МКПП имеется больше возможностей и техник (езда по грязи, льду, воде). Соответственно, даже неопытный водитель сможет справиться с управлением автомобилем в отсутствии ровного дорожного покрытия. При поломках транспортное средство с МКПП можно завести с разгона, также разрешается транспортировать машину на буксире без ограничений скорости перевозки.

У вас «сел» аккумулятор или вышел из строя стартер? Машину с «механикой» достаточно поставить на «нейтралку» и подтолкнуть, после чего включить третью передачу – и авто заведется! С «автоматом» такой фокус проделать не удастся.

Современные МКПП

Современные МКПП имеют разное число передач – от четырех до семи. Идеальной модификацией специалисты считают 5 и 6 передач, поскольку они обеспечивают оптимальное регулирование скорости автомобиля.

4-х ступенчатые коробки морально устарели, сегодня их можно встретить лишь на бу авто. Современные автомобили развивают высокие скорости движения, а «четырехступка» не предназначена для движения на скорости свыше 120 км/час. Поскольку здесь всего 4 передачи, то при движении с высокой скоростью приходится поддерживать высокие обороты, что ведет к преждевременному износу двигателя.

Семиступенчатая механика надежна и позволяет полностью контролировать динамику авто, но она требуется слишком часто переключать передачи, что может быть утомительным для водителя в условиях городской эксплуатации

Советы специалистов по эксплуатации МКПП

Как и любой другой сложный механизм транспортного средства, механическая коробка передач должна эксплуатироваться в строгом соблюдении правил завода-изготовителя машины. Выполнение этих простых правил, как показывает практика работы специалистов ГК Favorit Motors, способно замедлить износ деталей и сократить частоту поломок в агрегатах.

  • Переключение передач целесообразно выполнять в соответствии с рекомендациями производителей относительно разрешенной минимальной и максимальной скорости, предназначенной для каждой передачи. Помимо этого, производитель обычно приводит инструкции по экономичной эксплуатации транспортного средства. К примеру, для автомобиля Volkswagen Polo (двигатель 1.6, 110 л.с, 5МКПП) имеются рекомендации по экономичному расходу топлива: переключение на вторую передачу осуществлять на скорости 20 км/ч, на третью — при достижении 30 км/ч, на четвертую — при 40 км/ч и на пятую — при 50 км/ч.
  • Переключение на заднюю передачу (движение назад) должно производиться только при полной неподвижности автомобиля. Даже на малых скоростях переключение на заднюю передачу является недопустимым.
  • Выжимать педаль сцепления рекомендуется быстро, а отпускать — медленно и без рывков. Это позволяет уменьшить силу трения на выжимной подшипник и отсрочить необходимость ремонта.
  • При езде по скользкой дороге (гололед) нельзя бросать сцепление или ставить коробку передач на «нейтралку».
  • Не рекомендуется переключать передачи при крутых поворотах, это приводит к быстрому износу механизмов.
  • Любое транспортное средство нуждается в постоянном контроле количества масла в картере МКПП. Если по мере необходимости не доливать рабочую жидкость и не производить замену, то масло насыщается металлической пылью, что усиливает износ.
Подборка б/у автомобилей Volkswagen Polo

Как видите, продлить «жизнь» механической коробке вполне возможно. Для этого надо просто выполнять все рекомендации производителя, а при первых же сомнениях в качестве работы обращаться к специалистам ГК Favorit Motors.

Техцентры компании оснащены всем необходимым диагностическим оборудованием и узкопрофильными инструментами для диагностики неисправностей и ремонта МКПП.

Для выполнения ремонтно-восстановительных работ специалисты ГК Favorit Motors используют технологии, рекомендованные производителем, и качественные сертифицированные запчасти.

Мастера автосервиса обладают многолетним опытом работы и специализированными знаниями, что позволяет им быстро диагностировать неисправности и провести любые разновидности ремонта механических коробок передач. Каждый специалист регулярно проходит переподготовку в учебных центрах заводов-изготовителей и получает сертификат на право ремонта и обслуживания определенной марки авто.

К услугам клиентов автосервиса Favorit Motors – удобный график работы, онлайн запись на обслуживание и ремонт, гибкая программа лояльности, гарантия на запчасти и все виды ремонта механической коробки передач. Все необходимые комплектующие и расходные материалы имеются на складе компании.

Цена ремонта МКПП зависит от типа поломки и объема требуемых ремонтно-восстановительных работ. Обратившись в ГК Favorit Motors, вы можете быть уверены, что работоспособность «механики» будет восстановлена в кратчайшие сроки, а стоимость услуг не скажется негативно на семейном или корпоративном бюджете.


Механическая коробка передач (МКПП): особенности, преимущества и недостатки.

МКПП — механическая коробка переключения передач (в обиходе «механика») является разновидностью КПП и позволяет ступенчато изменять передаточное число (соотношение), при этом выбор и включение/выключение передачи осуществляется самим водителем вручную.

Свое название агрегат получил благодаря тому, что в его конструкции отсутствуют какие-либо электрические или гидравлические устройства, которые обязательно присутствуют в АКПП или РКПП.

Простыми словами, механическая коробка позволяет водителю самостоятельно выбирать необходимую ступень из доступных (с тем или иным передаточным числом) в зависимости от режима работы ДВС, нагрузки, дорожных условий и т. д.

Содержание статьи

Особенности работы ступенчатой коробки передач

Начнем с того, что данный тип КПП является самым простым и дешевым в производстве решением для обеспечения переменного передаточного числа трансмиссии. Также коробка-механика проста в ремонте и достаточно надежна. Сама ступенчатая механическая коробка передач представляет собой шестеренчатый редуктор, в котором передаточное число изменяется благодаря выбору пары шестерен с разным передаточным соотношением, которые передают крутящий момент.

Казалось бы, учитывая назначение и общий принцип работы КПП, чем больше передач имеет коробка, тем проще подобрать самый эффективный режим работы всей трансмиссии в зависимости от тех или иных условий. Также от оптимально подобранной передачи будет зависеть и расход топлива. Однако на деле в случае с МКПП имеются определенные сложности.

Как правило, в ступенчатой коробке имеются низкие, промежуточные и высокие передачи. Низших передач зачастую бывает не больше двух, а пара шестерен на таких передачах имеет самые большие передаточные числа. Указанные передачи нужны для того, чтобы стронуться с места и быстро разогнать автомобиль.

Также наличие пониженных передач позволяет двигаться на малой скорости под нагрузками, по снегу, размытым грунтовым дорогам и т.д. Даже если на низкой передаче обороты будут высокими, скорость движения значительно не увеличится, однако на колеса будет передаваться максимум мощности и крутящего момента.

При этом нужно учесть, что езда в таком режиме не позволит разогнать машину до высокой скорости, быстро изнашивает мотор и приводит к значительному увеличению расхода топлива, а также колеса на высоких оборотах могут потерять сцепку с покрытием, то есть машина начинает буксовать. 

По этой причине после того, как автомобиль начал движение, нужно переходить на более высокую (промежуточную) передачу. На такой передаче обороты  ДВС понижаются, снижается расход топлива, однако тяга и приемистость двигателя также ухудшаются, так как мотору нужно больше времени, чтобы выйти на высокие обороты.

Что касается повышенных передач, в этом случае задействованы пары шестерен с самым малым передаточным числом. Такие передачи нужны для движения с постоянной высокой скоростью. Силовой агрегат в таком режиме работает на средних и высоких оборотах, что позволяет мотору отдавать максимальную мощность, необходимую для преодоления сопротивления, которое создает встречный воздушный поток и т.д.

Другими словами, именно мощность ДВС позволяет противостоять влиянию тех факторов, которые воздействуют на автомобиль после набора высокой скорости, что в результате дает возможность разогнать машину до максимальных скоростей.

Добавим, что в зависимости от того, насколько плотным окажется ряд передач коробки, настолько менее заметным будет снижение оборотов двигателя после переключения передачи на одну ступень выше. Простыми словами, чем больше передач в КПП, тем активнее и плавне разгоняется автомобиль.

Читайте также

Картер маховика (мех. коробка передач) Cummins 6ISBe 2831367

Кожух маховика механической коробки передач двигателя Cummins 6ISBe Артикул 2831367

5301685 Housing, Flywheel 1  
2831367 Housing, Flywheel 1  
4899132 Insert, Threaded 8  
3089316 Screw, Hex Flange Head Cap 1  
3332242 Screw, Hex Flange Head Cap 1  
3900629 Screw, Hex Flange Head Cap 4 M8 X 1. 25 X 16
3900634 Screw, Hex Flange Head Cap 2 M10 X 1.50 X 50
3900635 Screw, Hex Flange Head Cap 1 M10 X 1.50 X 60
3900679 Screw, Hex Flange Head Cap 2 M10 X 1.50 X 80
3902451 Screw, Hex Flange Head Cap 1 M12 X 1.75 X 90
3903464 Screw, Hex Flange Head Cap 4 M10 X 1.50 X 40
3908095 Plate, Cover 1  
3910248 Plug, O Ring 1  
3910260 Seal, O Ring 1  
3914177 Screw, Hex Flange Head Cap 6 M12 X 1.75 X 80
3922863 Screw, Hex Flange Head Cap 1 M10 X 1.50 X 110
5259499 Seal, Oil 1 Service as 4955566
4892239 Plate, Cover 1  
4893494 Gasket, Cover Plate 1 Mechelen Part
       
  $Service Parts    
3934486 Rr Crankseal Serv Kit A/R  
5259499 Seal, Oil 1 Service as 4955566
3904325 Tool, Seal Installation 1  
3909409 Tool, Seal Installation 1  

 

Двигатель Cummins серии ISB / ISD устанавливается на:

— Автобусе Higer KLQ-6885-Q;

— КамАЗ 6540 (300 л. с.), 53605 (285 л.с.), 4308 (245 л.с.), 65117 (300 л.с.), 5308 (285 л.с.),

 4308-6064-79(С3)(245 л.с.), 4308 (210 л.с.), 43253 (210 л.с.), 4308 (185 л.с.), 43253 (185 л.с.),

65115 (300 л.с.), 45144 (285 л.с.), 65115 (285 л.с.), 43255 (185 л.с.)

— Грузовиках AVIA:

 D60 / D75 / D80;

 D85 / D90 / D100;

 D110 / D120;

-ПАЗ-320402-05, ПАЗ-3237, ПАЗ «Вектор» междугородное исполнение (ПАЗ-4234-40%), ПАЗ-320412-05 (ПАЗ-4234-40%), КАВЗ-4235-32/12, КАВЗ-4235-33/13;

— КАВЗ-4238-02, КАВЗ-4238-05 (школьный)

-ЛиАЗ-525653-01 пригород, ЛиАЗ-525626-20 (школьный), ЛиАЗ-525653, ЛиАЗ-529353, ГолАЗ-ЛиАЗ-5256.58

-НефАЗ-5299-20-32, НефАЗ-5299-20-33, НефАЗ-5299-10-32, НефАЗ-5299-30-32, НефАЗ-5299-30-33, НефАЗ-5299-11-32, НефАЗ-5299-37-32, НефАЗ-5299-17-32, НефАЗ-5299-20-22, НефАЗ-5299-30-22

А так же на марках: Yutong, Golden Dragon, MAN, DongFeng, Волжанин, MAP3, Iveco, Avia, Баз, Zhong Tong итд.

механика или автомат? — журнал За рулем

В статье рассказывается о преимуществах и недостатках автоматической и механической коробки передач.

Автоматическая коробка передач, механическая коробка передач, автомобиль. При выборе автомобиля с механической (МКПП) или автоматической (АКПП), желательно ознакомиться с особенностями работы тех и других механизмов. Даже пользователи, не разбирающиеся в автомобилестроении, после прочтения изложенной ниже информации, смогут определиться с верным для себя выбором. Существует стереотип, что коробка-автомат является модным и современным выбором, она проста в использовании и неприхотлива в обслуживании, в то время как механика — очень заумная конструкция, которая подходит лишь людям с большим опытом вождения, да и в целом, уже превратилась в пережиток прошлого. Эти утверждения не всегда верны, а в некоторых случаях в корне ошибочны.  Для многих людей, при покупке машины важным критерием является цена. Автомобиль, обладающий автоматической коробкой передач будет стоить в среднем на 1000 долларов дороже, чем автомобиль на механике. Колебания в разнице цены зависят от класса средства передвижения.  В легкости управления, преимущество, и вправду, у АКПП. Такие автомобили идеально подходят для городов, где присутствует проблема дорожных пробок. Нет нужды постоянно переключать передачи каждые пару метров, стараясь продвинуться в ней  ‘’Езда’’ в пробке на автомобиле с автоматической коробкой передач станет пусть не удовольствием, но не будет столь напряженной как с механической коробкой. Следующий критерий в выборе «„стального коня“» — расход топлива. Он больше в АКПП, но несущественно, примерно один литр на сто километров. А при плавной езде и отсутствии резкого старта расход топлива будет таким же, как и в МКПП. Обслуживание и ремонт механической коробки передач в разы проще и дешевле. Например, замена масла производится раз в несколько лет и проделать это можно на любом СТО. Стоимость данной процедуры невелика и занимает от силы полчаса. В автоматической коробке передач, роль масла исполняет жидкость под названием АТФ. В этих конструкциях не предусмотрена жесткая сцепка двигателя с коробкой. И сцепление происходит с помощью гидротрансформатора, в работе которого и берет участие АТФ. Но от слишком высокого перегрева она довольно быстро теряет свои свойства. В новых авто замену жидкости следует производить каждые 50 тысяч километров.  Что касается ремонта, то согласно статистике, МКПП ломаются гораздо реже, в то время как ремонт АКПП требует большого профессионализма и не меньше 1000 долларов в кармане.  Автоматическая коробка требует более «нежного» к себе отношения. Недостаток или излишек АТФ будет критичным для ее правильного функционирования. В случае разрядки аккумулятора, завести авто с толкача или с буксира не получится.  Вождение зимой не имеет преимущественных различий. Единственное уточнение — перед ездой АКПП необходимо прогреть, чтобы АТФ пришла в свое рабочее состояние. При торможении по льду нельзя включать пониженную передачу, следует отпустить педаль газа и ожидать, когда коробка самостоятельно переключится.  Выбор трансмиссии зависит от предпочтений водителя и его водительского стажа. Подведя итоги, можно сказать, что автомобиль с АКПП более прост в управлении, тем не менее, учиться водить лучше на механике. Так как после нее пересесть на автомат не составит труда, а вот наоборот будет достаточно затруднительно. А для машин с мощностью выше 200 лошадиных сил, тип коробки передачи вообще не имеет значения, но начиная с определенной ценовой категории, предусматривается лишь автомат.

Материал подготовлен автором личного блога. Редакция ЗР может не разделять мнения автора.

Понравилась заметка? Подпишись и будешь всегда в курсе!

За рулем на Яндекс.Дзен

Устройство коробки переключения передач: схема, принцип работы МКПП

Коробка переключения передач (сокр. КПП или коробка передач) предназначена для изменения крутящего момента, передаваемого от коленчатого вала двигателя к ведущим колесам, для движения автомобиля задним ходом и длительного разобщения двигателя от трансмиссии во время стоянки автомобиля и при движении его по инерции.
Устройство механической коробки передач (кликабельно). Механическая коробка передач — КПП, в которой выбор передач и их включение осуществляется вручную, механическим способом. Механическая коробка передач уже не является наиболее распространенным типом КПП из применяемых на автомобилях сегодня. Однако она все еще остается достаточно востребованной благодаря своей надежности, простоте конструкции и ремонтопригодности.

Содержание статьи:

Устройство механической коробки передач

Схема работы КПП: 1 — первичный вал; 2 — рычаг переключения; 3 — механизм переключения; 4 — вторичный вал; 5 — сливная пробка; 6 — промежуточный вал; 7 — картер.Конструктивно МКПП состоит из следующих элементов:

  • картера;
  • первичного, вторичного и промежуточного валов с шестернями;
  • дополнительного вала и шестерни заднего хода;
  • синхронизаторов;
  • механизма переключения передач с замковым и блокировочным устройствами;
  • рычага переключения.

Сцепление

Сцепление является неотъемлемым компонентом механической КПП, осуществляющим разъединение двигателя и коробки в момент переключения ступеней без последствий для агрегатов. Говоря упрощенно — сцепление отключает крутящий момент. В момент выжатой педали сцепления мотор и колеса автомобиля вращаются отдельно друг от друга.

Сцепление создано для аккуратного соединения мотора и колес. Состоит из двух дисков, один из которых соединен с двигателем, второй — с колесами. В момент отпускания педали сцепления диски прижимаются и начинаются вращаться вместе. Именно поэтому и важна плавность отпускания педали.

Шестерни и валы

В стандартных МКПП оси валов расположены параллельно, на них располагаются шестеренки.
Ведущий (первичный) вал присоединяется к маховику мотора через корзину сцепления, находящиеся на нем продольные выступы передвигают второй диск сцепления и передают через жестко закрепленную ведущую шестерню вращающий момент на промежуточный вал.

В хвостовике ведущего вала расположен подшипник, к которому примыкает конец вторичного. Отсутствие фиксированной связи делает возможным крутиться валам независимо друг от друга в разных направлениях и с разными скоростями.

На ведомом вале имеется целый набор различных шестерней как жестко закрепленных, так и свободно вращающихся.

Синхронизаторы

Угловые скорости первичного и вторичного валов уравниваются при содействии синхронизатора и становится возможным смена ступени. Синхронизаторы обеспечивают более щадящий режим эксплуатации КПП и пониженный шум.
Во время включения водителем передачи муфта подается в сторону нужной шестеренки. Во время перемещения усилие переходит на одно из блокировочных колец муфты. За счет разных скоростей между шестерней и муфтой конические поверхности зубьев взаимодействуют с помощью силы трения. Она поворачивает блокировочное кольцо на упор.

Зубья последнего устанавливаются против зубьев муфты, поэтому последующее смещение муфты становится невозможным. Муфта заходит без противодействия в зацепление с малым венцом на шестерне. Шестерня за счет такого соединения жестко блокируется с муфтой. Такой процесс осуществляется за доли секунды. Один синхронизатор обычно обеспечивает включение двух передач.

Виды механических КПП

По количеству ступеней (передач) механические коробки в основном подразделяются на:

  • 4-ступенчатую;
  • 5-ступенчатую;
  • 6-ступенчатую.

Наиболее распространенной механикой считается 5МТ, то есть пятиступенчатая коробка переключения передач.

По количеству валов МКПП подразделяются на:

  • двухвальные, устанавливаемые на легковые переднеприводные автомобили;
  • трехвальные, устанавливаемые на легковые заднеприводные, а также на грузовые автомобили.

Принцип работы МКПП

Суть функционирования МКПП состоит в создании соединений между первичным и вторичным валом путем варьирования шестерней с различным количеством зубьев, что адаптирует трансмиссию под постоянно меняющиеся обстоятельства передвижения транспортного средства.

Данный силовой агрегат обеспечивает необходимые режимы работы мотора путем изменения количества оборотов, изменяя передаваемое усилие на ведущие колеса. Соответственно, при уменьшении количества оборотов снижается передаваемое усилие, а при увеличении — увеличивается. Это необходимо при удержании требуемого режима работы мотора при начале движения, снижении скорости или разгоне.

Двухвальная коробка передач: устройство и принцип работы

В таких трансмиссиях вращающий момент передается от шестеренок первичного вала на шестеренки ведомого. Ведущий вал соединяется с мотором через маховик, а ведомый передает вращающий момент на передние колеса. Располагаются они параллельно.

Ведущая шестеренка главной передачи на вторичном валу крепко зафиксирована. Между шестеренками находятся муфты синхронизаторов.

Для уменьшения габаритов агрегата и для увеличения количества ступеней устанавливается до трех вторичных валов, на каждом из них стоит шестеренка главной передачи, которая постоянно взаимодействует с ведомой шестеренкой.

Главная передача и дифференциал трансформируют вращающий момент вторичного вала на ведущие колеса машины.

Трехвальная коробка передач: устройство и принцип работы

Подшипники, расположенные в корпусе, обеспечивают вращение валов. На каждом валу имеется комплект шестеренок с различным числом зубьев.

Ведущий вал примыкает к двигателю посредством корзины сцепления, ведомый с карданным, промежуточный передает вращающий момент вторичному.

На первичном валу имеется ведущая шестеренка, которая раскручивает промежуточный с расположенным на нем крепко зафиксированным набором шестеренок. На ведомом валу имеется свой комплект шестеренок, перемещающихся по шлицам.

Между шестеренками вторичного вала находятся муфты синхронизаторы, которые выравнивают угловые скорости шестеренок с оборотами самого вала. Синхронизаторы крепко закреплены на валах и передвигаются в продольном направлении по шлицам. На современных МКПП такие муфты находятся на каждой ступени.

Преимущества и недостатки МКПП

Преимущества Недостатки
Стоимость и масса коробки ниже в сравнении с другими типами КПП Меньший уровень комфорта для водителя в сравнении с другими КПП
Высокие динамика разгона, топливная экономичность и КПД Утомляющий для водителя процесс переключения передач
Высокая надежность за счет простоты конструкции Необходимость периодической замены сцепления
Простое и недорогое обслуживание Более низкая плавность хода автомобиля в сравнении с другими типами КПП
Возможность более эффективного движения по бездорожью При неправильной эксплуатации повышенные нагрузки на ДВС

Как пользоваться механической коробкой

Использование автомобиля с механической КПП имеет некоторые особенности, которые нужно знать автолюбителю.

Во-первых, это последовательность действий при запуске машины:

  • выжать педаль сцепления до упора и передвинуть рычаг КПП в положение нейтральной передачи, если есть сомнения правильно ли выбрана скорость необходимо пошевелить рукоятку рычага в стороны, при нахождении рукоятки КПП в нейтральном положении рычаг свободно ходит вправо и влево;
  • при переводе автомобиля на нейтральную ступень необходимо зафиксировать транспорт во избегании неконтролируемого движения, для этого машина ставится на ручной тормоз или выжимается педаль тормоза;
  • при выжатом сцеплении и удерживании машины тормозом необходимо повернуть ключ зажигания, при этом должны загореться значки на панели приборов, как только потухнут почти все значки следует дальше повернуть ключ и после запуска двигателя отпустить ключ.

Во-вторых, схема переключения на МКПП. Она чаще всего находится на внешней части рукоятки рычага. При переключении передачи рекомендуется ориентироваться на тахометр. Переключаться на более высокую передачу можно раскрутив обороты двигателя до 1500–2000 об/мин в случае дизельного мотора и до 2000–2500 об/мин в случае бензинового.

В-третьих, процесс переключения передач. Он состоит из нескольких этапов:

  • отпустить педаль газа;
  • левой ногой выжать педаль сцепления до упора;
  • рукой передвинуть рычаг в необходимое положение;
  • аккуратно отпустить педаль сцепления и потихоньку нажать педаль акселератора.

В-четвертых, регулярная проверка уровня рабочей жидкости и замена ее согласно указаниям производителя продлят период эксплуатации механической КПП.

Заключение

В большинстве стран с более высоким доходом населения количество выпускаемых авто с МКПП уменьшено практически до 10-15%. Связано это в первую очередь с комфортом во время вождения — при использовании АКПП он несомненно выше. Механическая КПП имеет самый простой принцип работы. Из-за этого она дешевле и экономичнее. МКПП является отличным решением для любителей быстрой езды или езды по бездорожью. Если комфорт для вас не является первостепенным, то выбор в пользу МКПП очевиден.

Пять причин, почему «механика» лучше «автомата» — Российская газета

Автоматическая коробка передач давно перестала быть спутницей премиальных машин. Однако механическая все равно не теряет своих позиций не только в России, но и в Европе. Каковы ее преимущества?

Первая и главная причина — это надежность ручной коробки. Серьезное обслуживание ей не нужно в течение всего срока службы. Ключевых пункта в эксплуатации два: менять масло через каждые 60 тысяч километров и сцепление через 120 тысяч. При этих двух относительно небольших видах трат «механика» может спокойно пройти больше 500 тысяч километров. А вот гидромеханический автомат или вариатор нужно ремонтировать уже через 150 тысяч, пишет aif.ru.

Во-вторых, механическая коробка более экономична. Энергия вращения коленного вала у нее не уходит в гидротрансформатор, валы здесь связаны напрямую. Автомат с незаблокированной муфтой может тратить до 30 процентов энергии, разогревая трансмиссию. Для отвода тепла здесь нужны дополнительные радиаторы. А «механика» дополнительного охлаждения не требует. Отсюда следует ее экономичность в пробках и на небольших скоростях.

Третья причина — обороты двигателя, которые выбирает сам водитель. В поворотах, в перестроении это бывает очень полезно. Драйверы любят подрифтовывать на пониженных передачах. Кстати, спортивные машины чаще всего получают механическую коробку.

В-четвертых, машина с механической коробкой передач гораздо лучше ведет себя на бездорожье. Если автомобиль забуксовал, его раскачивают, переключая с первой на вторую скорости. Если же начать быстро менять режимы на автомате, она застрянет еще больше. Также «механику» проще запустить с толкача. Или же отбуксировать. В то время как для «автомата» нужен будет эвакуатор.

Пятая причина — способность механической трансмиссии давать дополнительные бонусы в гористой местности. В частности, тормозить двигателем на спуске под уклон. Если включить пониженную передачу, топливо будет экономиться, а колодки с дисками не будут быстро стираться. «Автомату» такое не под силу. На спуске с горы всегда придется задействовать тормоза, которые могут перегреваться и терять эффективность.

Ferric Uptake Regulator — обзор

4.2.1 Структура сайта связывания Fur (Fur Box) и факторы, влияющие на взаимодействия Fur-ДНК у цианобактерий

Fur (белок-репрессор) образует комплекс с высококонсервативными инвертированными повторами длиной 19 п.н. (Меховой бокс; 5′-GATAATGATAATCATTATC-3 ‘), расположенный выше промоторной области железо-чувствительных генов у цианобактерий (рис. 4) (Kaushik et al., 2015). Коробки для меха обычно характеризуются наличием области AT. Гексамерная модель продемонстрировала присутствие тандемных повторов трех прямо-обратных гексамеров (5’-GATAAT-3 ‘) с блоком распознавания Fur (5′-NAT (A / T) AT-3’) в этих консервативных инвертированных повторах (Escolar и другие., 1998). Однако далее было высказано предположение, что сайт связывания Fur представляет собой сердцевину из 15 п.н., образованную мотивом гептамера 7-1-7 (Baichoo and Helmann, 2002). Наполитано и др. (2012) также сообщили, что сайты связывания Fur представляют собой консенсусные последовательности, содержащие 7-1-7 инвертированных повторов в Anabaena sp. PCC 7120. Gonzalez et al. (2011) далее сообщили о специфической последовательности в Fur-связывающем сайте в дополнение к консенсусным последовательностям, содержащим 7-1-7 инвертированных повторов в Anabaena sp. PCC 7120, который необходим для эффективного связывания белков меха.

In Anabaena sp. PCC 7120, Gonzalez et al. (2014) сообщили о боксах FurA в двунаправленном промоторе генов, участвующих в метаболизме железа ( all0396-schT , all2624-alr2625 , all2586-alr2587 , alr2594-alr2595 ), фотосинтезе и дыхании , ccmK-ndhF ) и несколько других метаболизмов ( znuA-oprB , hupL3-xisC , nifD3-xisA ). Сайты связывания Fur, расположенные в двунаправленном промоторе генов-мишеней, управляют одновременной регуляцией генов с перекрывающимися промоторами (Lavrrar et al., 2003). Кластер генов all2641-all2649 , контролирующий продукцию сидерофоров и систему транспорта железо-сидерофор, несет несколько количеств Fur-боксов в разных межгенных областях с разной аффинностью связывания и последовательно модулирует экспрессию гена при разном статусе железа (Gonzalez et al., 2012) . В Anabaena sp. PCC 7120, Fur боксы также были расположены в вышестоящих промоторных областях генов, участвующих в каскаде передачи сигнала, то есть aphC (кодирует двухкомпонентную сенсорную гистидинкиназу; предполагаемый фоторецептор), cyaC (кодирует аденилатциклазу, несущую двухкомпонентный сенсор). и регуляторный домен), asr (кодирует бактериородопсин) и cyaD (кодирует аденилатциклазу) (Gonzalez et al., 2014). Промотор гена, кодирующего транспозазу ( all4465 ) в Anabaena sp. PCC 7120 также имеет меховую коробку (Gonzalez et al., 2014). Более того, znuA , cyaD , aphC , alr0240 и pbpH также совместно модулировались FurA и другими регуляторами транскрипции при ограничении железа в Anabaena sp. PCC 7120 (Gonzalez et al., 2014). В Anabaena sp. PCC 7120, FurB совместно регулирует оперон znuAB , ответственный за экспрессию компонентов высокоаффинного механизма захвата цинка (Napolitano et al., 2012). Двунаправленный промотор mcyDA (P mcy DA ) в M. aeruginosa PCC 7806 также имеет два предполагаемых бокса Fur в области между генами mcyA и mcyD (Martin-Luna et al., 2006 ). Более того, промоторы генов кластера mcy , то есть генов mcyE , mcyH , mcyG и mcyJ , также содержат AT-богатые области, имеющие различные оценки соответствия с ранее определенным консенсусом в других цианобактерии (Hernandez et al., 2006b).

Hernandez et al. (2002) определили термодинамику и конформационную стабильность структуры меха у Anabaena sp. PCC 7119, который, как предполагалось, представляет собой димер, имеющий два домена, где С-конец (участвующий в димеризации белка) состоит из длинной α-спирали и пяти β-цепей, а N-конец (отвечающий за способность связывания ДНК) имеет два спираль поворачивает спиральные мотивы вместе с четырьмя спиральными структурами (Hernandez et al., 2002). У Anabaena sp. FurA сворачивается с помощью двух механизмов состояний и включает 40% α-спирали (Hernandez et al., 2002). В отличие от меха Bacillus subtilis и Pseudomonas aeruginosa , у Anabaena Fur не наблюдалось никаких карманов, связывающих цинк (Pohl et al., 2003). У цианобактерий подобная факторам архитектура Furbox, присутствие ионов двухвалентных металлов, окислительно-восстановительный статус цистеина и гистидина, ионные взаимодействия и участие эффекторов, таких как гем, определяют аффинность, стабильность и качество взаимодействия Fur-ДНК (Hernandez et al. др., 2002; Пеллисер и др., 2012). Escolar et al. (1998) ранее предположили, что основания A и T в положениях 5 и 6 гексамера в Fur-связывающем сайте важны для взаимодействия Fur-ДНК. Однако Gonzalez et al. (2011) далее сообщили, что это не основания A и T, а архитектура сайта связывания Fur, которая играет решающую роль в связывании Fur. Некоторые исследователи также сообщили, что ион Zn 2 + контролирует связывание Fur с ДНК (Xiong et al., 2000; Zheleznova et al., 2000), но позже Zn 2 + -независимая сверхэкспрессия активного рекомбинантного FurA белки обнаружены у Anabaena sp.PCC 7119 (Hernandez et al., 2002).

Hernandez et al. (2006b) продемонстрировали, что ион Mn 2 + и окислительно-восстановительный статус белка Fur также влияют на взаимодействие Fur-ДНК в Anabaena sp. Присутствие иона Mn 2 + усиливает стабильность взаимодействия Fur-ДНК, а также влияет на олигомеризацию мономера Fur (Hernandez et al., 2002). Более того, окислительно-восстановительный статус цистеина в Fur также влияет на взаимодействие Fur-ДНК и олигомеризацию мономера Fur (Hernandez et al., 2002). Anabaena Fur имеет пять остатков цистеина, четыре из них расположены в двух мотивах CXXC, и только один цистеин используется для распознавания ДНК и активности связывания металлов. Ботелло-Морте и др. (2014) сообщили о мотиве CXXC (C 101 XXC 104 ) с новой дисульфидредуктазной активностью в Anabaena sp. PCC 7120, который показал сходство с последовательностями, наблюдаемыми в активных центрах тиоредоксинов и тиоредоксин-подобных белков. Тиоредоксин и тиоредоксиноподобные белки уменьшают структурно важные дисульфидные связи в целевом белке и поддерживают окислительно-восстановительный гомеостаз (Quan et al., 2007). Подобный мотив, действующий как окислительно-восстановительный реостат, также наблюдался в глутаредоксинах (Florencio et al., 2006), пероксиредоксинах (Latifi et al., 2009), белках Dsb (Heras et al., 2007), а также в эукариотическом белке. -дисульфидизомеразы (Sevier, Kaiser, 2002). В отличие от Anabaena sp. PCC 7120, семь окислительно-восстановительных остатков цистеина присутствуют в Fur из M. aeruginosa PCC 7806, которые отличаются по его c-концу по сравнению с другими гомологами меха. Мартин-Луна и др.(2006) продемонстрировали, что из семи остатков цистеина только пять являются высококонсервативными, однако расположение всех остатков цистеина такое же, как у других цианобактерий. Остатки цистеина, идентифицированные в M. aeruginosa PCC 7806 Fur, также участвуют в связывании металлов и олигомеризации белков (de Orue et al., 2000). Редокс-активный цистеин в Fur также регулирует степень олигомеризации белка Fur, влияя на белок-белковые взаимодействия (Hernandez et al., 2002).

In Anabaena sp. PCC 7120, гем (редокс-кофактор) также влияет на взаимодействие Fur-ДНК, образуя комплекс Fur-гем, который ингибирует связывание Fur in vitro с генами-мишенями даже в присутствии иона Mn 2 + (Hernandez et al. , 2004b). Остатки гистидина и цистеина критически влияют на образование комплексов Fur-гем (Paoli et al., 2002). Pellicer et al. (2012) провели сайт-направленный мутагенез и спектральные исследования, предположив, что Cys141, расположенный в мотиве Cys-Pro (дипептид Cys141-Pro142) на С-конце, является аксиальным лигандом гема Fe (III).У прокариот (кроме E. coli ) мотив Cys-Pro участвует в способности чувствовать гем (Ogawa et al., 2001). У цианобактерии Anabaena sp. PCC 7120, образование комплекса Fur-heme вызывает конформационные изменения в сайте связывания металла белка Fur, что ингибирует сродство связывания Mn 2 + с белком Fur in vitro (Hernandez et al., 2004b). Лопес-Гомоллон и др. (2009) также продемонстрировали гем-зависимое нарушение связывающей способности FurB и FurC у Anabaena sp.PCC 7120; однако гомолог FurC не подвергался влиянию гема.

Регулятор поглощения железа (Fur) и доступность железа контролируют выработку и созревание антибактериального пептида микроцина E492

Abstract

Микроцин E492 представляет собой порообразующий бактериоцин с токсической активностью против Enterobacteriaceae , который подвергается агрегации амилоида в качестве механизма, регулирующего его токсичность. Чтобы быть активным, он требует посттрансляционного присоединения к С-концу гликозилированного производного энтерохелина (сальмохелина), процесс осуществляется белками MceC, MceI и MceJ, кодируемыми в кластере генов MccE492.И микроцин E492, и сальмохелин предположительно играют роль в вирулентности бактериального патогена Klebsiella pneumoniae . Кроме того, энтерохелин вырабатывается в результате низкой доступности железа, а его синтез контролируется глобальным регулятором железа Fur. Поскольку производство активного микроцина E492 зависит от биосинтеза энтерохелина, оба процесса могут координироваться. В данной работе мы исследовали роль Fur в экспрессии генов созревания микроцина E492 mceCJI . mceC не был , регламентированный компанией Fur, как это происходит с его гомологом iroB в Salmonella enterica . Мы продемонстрировали, что mceJI вместе с ранее не охарактеризованным геном mceX транскрибируются как одна мРНК, и что Fur связывает in vivo с коробкой Fur, расположенной перед единицей mceX mceJI . Также мы установили, что экспрессия этих генов снижается в условиях высокой доступности железа, в то время как этот эффект отменяется на фоне Δ fur .Кроме того, наши результаты показали, что MceX действует как негативный регулятор экспрессии структурного гена микроцина E492, связывая его синтез с железозависимой регуляторной цепью. Следовательно, сверхэкспрессия fur или mceX приводила к значительному снижению антибактериальной активности клеток, продуцирующих микроцин E492. В совокупности эти результаты показывают, что как экспрессия генов созревания микроцина E492 mceJI , так и MceX, негативный регулятор синтеза микроцина E492, координируются с продукцией энтерохелина Fur в зависимости от уровней железа в среде.

Образец цитирования: Marcoleta AE, Gutiérrez-Cortez S, Hurtado F, Argandoña Y, Corsini G, Monasterio O, et al. (2018) Регулятор поглощения железа (Fur) и доступность железа контролируют производство и созревание антибактериального пептида микроцина E492. PLoS ONE 13 (8): e0200835. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200835

Редактор: Эрик Каскалес, Национальный центр научных исследований, Университет Экс-Марсель, Франция

Поступила: 5 марта 2018 г .; Одобрена: 22 мая 2018 г .; Опубликовано: 2 августа 2018 г.

Авторские права: © 2018 Marcoleta et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантами 1100141 и 1140430, предоставленными Национальным фондом дезарролло сентифика и технологий (FONDECYT).

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Микроцин E492 (MccE492) представляет собой порообразующий бактериоцин массой ~ 8 кДа, который продуцируется и выделяется Klebsiella pneumoniae RYC492 [1-2]. Среди своих свойств MccE492 обладает антибактериальной активностью против Enterobacteriaceae , индуцирует апоптоз в некоторых линиях опухолевых клеток человека и формирует амилоидные волокна как механизм, регулирующий его активность [3-5].После синтеза он подвергается посттрансляционной модификации (созреванию) за счет присоединения к С-концу гликозилированных производных энтерохелина (сальмохелина), сидерофор, широко используемый Enterobacteriaceae . Добавление этой части важно для антибактериальной активности, поскольку она опосредует распознавание токсина и интернализацию в периплазму рецепторами катехолата железа (III) FepA, Fiu и Cir, расположенными на внешней мембране клеток-мишеней [6-8]. Хотя это не было продемонстрировано экспериментально, было высказано предположение, что продукция MccE492 и сальмохелина поможет превзойти другие бактерии во время колонизации окружающей среды, лишенной железа, такой как ткани млекопитающих.Более того, было обнаружено, что гены, участвующие в продукции этих молекул, широко распространены среди гипервирулентных K . pneumoniae штаммов [9–11] и, таким образом, вероятно, играют роль в патогенезе этого вида, недавно объявленного неотложным признаком патогена из-за его гипервирулентности и множественной лекарственной устойчивости (обзор в [12–13]).

Генетические детерминанты продукции активного MccE492 сгруппированы в кластер генов размером ~ 13 т.п.н., который был клонирован и изучен в E . coli [14]. Он включает (среди прочего) гены mceA и mceB , кодирующие пептид MccE492 и его иммунный белок, соответственно; mceH и mceG , кодирующие специальный транспортер ABC и его вспомогательный белок, и mceC , mceJ и mceI , продукты которых участвуют в созревании MccE492; мутанты по любому из генов созревания продуцируют неактивный MccE492 [15-17]. Белок MceC представляет собой гликозилтрансферазу из 370 аминокислот, которая катализирует присоединение фрагментов глюкозы к энтерохелину, образуя сальмохелин [16].Белки MceJ и MceI собираются в комплекс, который катализирует ковалентное присоединение сальмохелина к С-концевому концу (серин 84) MccE492 [16,18].

Бактериям, как и большинству живых форм, необходимо двухвалентное железо (Fe 2+ ) для осуществления многих метаболических процессов. Следовательно, один из первых защитных барьеров хозяина против патогенных инфекций состоит из специализированных белков, которые связывают этот питательный микроэлемент, снижая его биодоступность. В ответ бактерии разработали опосредованные сидерофором системы захвата железа, чтобы обойти эту стратегию защиты хозяина [19,20].В E . coli , белок регулятора захвата железа (Fur) — это шедевр, регулирующий клеточные уровни Fe 2+ [19,21–22]. Fur действует в основном как репрессор транскрипции и определяет доступность внутриклеточного железа: на высоких уровнях Fe 2+ действует как ко-репрессор, образуя комплекс Fur-Fe 2+ , который связывается с последовательностью из 19 пар оснований, обозначенной Fur box, обычно располагается в промоторной области генов, регулируемых железом [23,24-25]. Напротив, при низких уровнях Fe 2+ комплекс Fur-Fe 2+ разбирается, очищая промоторную область и обеспечивая экспрессию гена.Fur-опосредованная регуляция контролирует экспрессию более 90 генов [26], включая некоторые факторы вирулентности, такие как гемолизин и шига-подобный токсин, а также детерминанты, кодирующие синтез энтерохелина [24, 27–28]. Поскольку на предшественники посттрансляционной модификации MccE492 влияет доступность сидерофоров и, следовательно, процесс поглощения железа, вероятно, что метаболизм железа играет роль в регуляции созревания MccE492. В связи с этим предыдущая работа показала, что для активной продукции MccE492 обязательно требуется энтерохелин в качестве субстрата [17].Также известно, что ген iro B, кодирующий гомолог MceC в Salmonella , имеет Fur box в своей промоторной области, что позволяет Fur-опосредованной и железозависимой регуляции его экспрессии [20,29-30]. Хотя эти факты предполагают, что процесс созревания MccE492 связан с метаболизмом железа, прямое влияние Fur и доступности железа на экспрессию генетических детерминант MccE492 не изучено. В этой работе мы установили, что в отличие от своего гомолога iroB , mceC не регулируется Fur.Мы охарактеризовали промоторную область генов созревания mceJI и обнаружили, что они транскрибируются как полицистронная мРНК вместе с небольшой открытой рамкой считывания, названной mceX , расположенной выше mceJ . Промоторная область, управляющая экспрессией этой транскрипционной единицы, содержит Fur-бокс, перекрывающий сайт начала транскрипции, который связывает Fur-регулятор in vivo . Используя репортерные слияния lacZ , мы предоставили доказательства, указывающие на то, что экспрессия mceX и mceJI подавляется повышением концентрации железа в Fur-зависимом механизме, и мы установили, что MceX действует как негативный регулятор mceBA . единица, связывающая экспрессию белка MccE492 со схемой регуляции железа.Следовательно, избыточная экспрессия fur или mceX приводила к значительному снижению антибактериальной активности клеток, продуцирующих MccE492, поддерживая тесную связь между обоими регуляторами и биосинтезом и созреванием этого бактериоцина.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы и плазмиды

Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в этой работе, описаны в таблицах 1 и 2 соответственно.

Условия роста

Бактериальный рост выполняли путем разбавления в 1000–2000 раз ночной культуры в среде M9 с добавлением цитрата и глюкозы (2 г / л каждого) или в бульоне Лурия (LB, Difco) и инкубации при 37 ° C со встряхиванием (180 об / мин. ).При необходимости использовали антибиотики в следующих концентрациях: ампициллин (Amp) 100 мкг / мл, канамицин (Kan) 50 мкг / мл, тетрациклин (Tc) 50 мкг / мл, хлорамфеникол (Cm) 50 мкг / мл.

Методики рекомбинантной ДНК

Экстракция ДНК

, лигирование, расщепление рестрикционными ферментами и другие стандартные процедуры, не подробно описанные в дальнейшем, были выполнены в соответствии со стандартными протоколами [31] и инструкциями производителя. E . coli штамм DH5α использовали для поддержания и размножения конструкций ДНК.

Анализ активности MccE492 на планшетах

Определение антибактериальной активности в планшетах проводили, смешивая аликвоту 0,3 мл ~ 1 x 107 клеток / мл E . Индикаторный штамм coli с 3 мл мягкого агара M9 (0,7% мас. / Об. Агара) и нанесение на чашки, содержащие среду M9 с добавлением глюкозы и цитрата. Антибактериальная активность MccE492 определялась по образованию ореолов ингибирования роста. Площадь ореола была измерена (в квадратных пикселях) с помощью программного обеспечения ImageJ [32], а затем нормализована до эталонных условий.Газон чувствительный Е . coli BL21 (DE3) обычно использовали в качестве индикаторного штамма.

In silico идентификация регуляторных элементов перед генами созревания

Поиск промоутера выполнялся с использованием приложения BPROM, общедоступного по адресу http://linux1.softberry.com [33].

Экстракция РНК

Экстракцию

РНК проводили, как описано ранее [34], с небольшими модификациями. Вкратце, объем, соответствующий OD 600 = 4.0 бактериальной культуры смешивали с 1/5 объема раствора для остановки холода (5% фенол в этаноле), энергично встряхивали, замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до обработки. Образцы размораживали на льду и центрифугировали в течение 10 минут при 17000 x g (4 ° C). После удаления супернатанта бактериальный осадок суспендировали в 1 мл TRIzol (Ambion), и смесь переносили в пробирку для разделения фаз PLHG (Phase Lock Heavy Gel, Eppendorf). Затем 400 мкл CH 3 Cl добавляли в пробирку, энергично перемешивая в течение 10 с, инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут и центрифугировали 1 минуту при 17000 x g для разделения фаз.Водную фазу помещали в свежую пробирку, добавляли 1 объем изопропанола и смесь инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После центрифугирования (30 мин, 17000 x g) осадок промывали 350 мкл 75% этанола, а затем растворяли в воде с наночастицами. Концентрацию и чистоту РНК (соотношение A 260 / A 280 ) определяли с использованием спектрофотометра Nanodrop (Thermo Scientific).

ОТ-ПЦР

Перед синтезом кДНК образцы общей РНК обрабатывали ДНКазой I (Fermentas) в соответствии с протоколом производителя.После инкубации ДНКазу I удаляли экстракцией 1 объемом P: C: I (фенол / хлороформ / изоамиловый спирт, 25: 24: 1 об. / Об.), А затем осаждали РНК, добавляя 1/10 объемов 3M ацетата натрия. (pH 5,7) и 4 объема 100% этанола и инкубируют 1 ч на льду. После центрифугирования супернатант удаляли, а осадок один раз промывали 75% этанолом и растворяли в воде с наночастицами.

Реакции обратной транскрипции проводили с использованием обратной транскриптазы SuperScript III (Life Technologies), следуя инструкциям производителя.Каждую реакцию готовили с 2 мкг полной РНК, свободной от ДНК, и 2 пмоль соответствующего праймера. Реакции отрицательного контроля проводили с заменой обратной транскриптазы наночистой водой. После синтеза первой цепи образцы инкубировали с 1 ед. РНКазы H (Invitrogen) в течение 20 мин (37 ° C) и хранили при -20 ° C до использования. ПЦР-амплификацию проводили с 2 мкл каждой приготовленной кДНК, 1X буфера для полимеразы Taq , 0,25 мМ dNTP, 0,5 пмоль каждого конкретного праймера и 0,025 ед. Полимеразы Taq .Для амплификации mceX / mceJI использовались праймеры JVO-5475 / JVO5476 ( mceX ), JVO-5475 / JVO-5477 ( mceX mceJ ) и JVO-5479/5478 миллионов долларов США миллионов долларов США ). Температурный профиль для циклов амплификации составлял 95 ° C / 10 мин, 35 x (95 ° C / 40 с, 57 ° C / 40 с, 72 ° C / 45 с), 72 ° C / 10 мин. Продукты амплификации выявляли электрофорезом в 2% агарозном геле и окрашиванием бромидом этидия.

Анализ 5 ’RACE

Определение сайта начала транскрипции для транскрипционной единицы mceX / mceJI с помощью анализа 5 ’RACE проводили в соответствии с общей стратегией, описанной Урбаном и Фогелем [35].Вкратце, тотальную РНК экстрагировали из культур с поздней экспоненциальной стадией E . coli VCS257, несущая плазмиду pJAM229, выращенная в минимальной среде M9 с добавлением глюкозы / цитрата (OD 600 = 0,8). Загрязняющую ДНК удаляли обработкой ДНКазой I (как описано в методе ОТ-ПЦР). Затем 12 мкг свободной от ДНК РНК смешивали с 10 мкл 10-кратного ТАП-буфера и водой, свободной от РНКазы, до получения общего объема 98 мкл. Эту смесь разделили на две пробирки, затем к одной добавили 10 единиц TAP (Epicenter Technologies) и к контролю добавили эквивалентный объем воды.Образцы инкубировали при 37 ° C в течение 30 мин. После инкубации добавляли 300 пмоль адаптера РНК A4 (см. Таблицу 3), и смесь РНК дополнительно очищали экстракцией P: C: I и осаждением этанолом. Затем осадок РНК суспендировали в воде, свободной от РНКазы, и лигирование РНК-адаптера выполняли с использованием 40 ЕД РНК-лигазы Т4 (New England Biolabs), следуя инструкциям производителя. После второго раунда экстракции P: C: I и осаждения этанолом полученную РНК использовали для синтеза кДНК, как описано в разделе о методе ОТ-ПЦР, с использованием 100 пмоль случайных гексамеров в качестве праймеров.ПЦР-амплификацию с кДНК, полученной выше, проводили с использованием праймеров JVO-5476 ( mceX ) и JVO-5477 ( mceJ ) в сочетании со специфическим праймером, направленным на адаптер РНК A4 (JVO-0366). ПЦР-ампликоны дополнительно визуализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Для анализа последовательности выбранные полосы ДНК вырезали из геля, очищали с помощью набора Quickspin (Qiagen) и клонировали в pCR4®-TOPO®, следуя рекомендациям производителя. Секвенирование проводили с использованием универсальных праймеров M13F и M13R.

Тесты для титрования меха (FurTA)

Обнаружение связывания Fur in vivo с предполагаемыми коробками Fur проводили с использованием анализа FurTA, описанного ранее [36]. Вкратце E . Штамм coli h2717, несущий хромосомную копию Fur-регулируемого промотора fhuF , слитого с геном lacZ , трансформировали многокопийными плазмидами, несущими тестируемые сегменты ДНК. Полученные штаммы затем помещали в чашки с агаром MacConkey с добавлением 60 мкМ FeSO 4 и инкубировали в течение ночи при 37 ° C.Окраска колоний от оранжевого до красного указывает на то, что тестируемый сегмент ДНК имеет функциональный меховой бокс, который может изолировать мех, предотвращая его связывание с промотором fhuF и обеспечивая экспрессию гена lacZ , что приводит к окрашиванию колоний. .

Конструкции pFurC, pFurD, pFurE, pFurX, pXH и pHF, содержащие отдельные области тестируемого кластера генов MccE492, были созданы путем амплификации каждой области с помощью ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Pfu и клонирования ампликонов в Eco RV-сайте pACYC184. .Для создания pFurC фрагмент размером 346 п.н. амплифицировали с использованием праймеров FurC и PEC. pFurD был сконструирован путем клонирования фрагмента длиной 268 п.н., амплифицированного с использованием праймеров FurD и PED. pFurE был сконструирован путем клонирования фрагмента размером 240 п.н., амплифицированного с использованием праймеров PEE и FurE2. pFurX был сконструирован путем клонирования фрагмента длиной 237 п.н., амплифицированного с использованием праймеров FurX и PEX. pXH был сконструирован путем клонирования в pACYC184 фрагмента ДНК размером 3,5 т.п.н., амплифицированного с помощью ПЦР с использованием праймеров mceXReFW1 и mceHReRV1. Наконец, для создания pHG фрагмент размером 3,7 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров mceHReFW1 и mceFReFW1.

Изготовление

lacZ репортерных слитков Слияния

LacZ были сконструированы путем амплификации с помощью ПЦР желаемой области генетического кластера MccE492 с использованием праймеров, содержащих сайты рестрикции Fse I или Not I, а затем лигирование их с каркасом pACYC184 и с геном lacZ , амплифицированным из pPelican. плазмиду с использованием праймеров LacZ-Pelic-F и LacZ-Pelic-R. Гены mceBA , mceC и mceJI (включая область размером ~ 500 п.н. перед стартовым кодоном) были амплифицированы с использованием pJAM229 в качестве ДНК-матрицы и праймеров Mcc-Fus-F и Mcc-Fus-R ( mceBA ), C-Fus-F и C-Fus-R ( mceC ) или JI229-Fus-F и JI229-Fus-R ( mceJI ).Таким образом, мы получили плазмиды p mceBA ’-‘ lacZ , p mceC ’-‘ lacZ и p mceJI ’-‘ lacZ . Альтернативно, праймеры JI434-Fus-F / JI229-Fus-R использовали для создания плазмиды p mceJI ΔTSS’- ‘ lacZ . p mceX ’-‘ lacZ , был сконструирован с использованием метода инвертированной ПЦР, начиная с p mceJI ’-‘ lacZ . Вкратце, расходящиеся праймеры для ПЦР mceX-Fus-R и JVO5481 (фосфорилированные на 5 ’конце) и высокоточная полимераза Phusion (New England Biolabs) использовали для ПЦР-амплификации области поддерживаемой плазмиды.Затем матричную плазмиду удаляли расщеплением Dpn I, а продукт ПЦР самолигировали и трансформировали в TOP10 E . coli клеток. p mceJ 17’- ‘ lac Z был получен через службу мутагенеза, предлагаемую Genscript Inc., начиная с p mceJI ’-’lacZ.

Конструкция плазмиды p15A-

fur и pT5- mceX

Для клонирования IPTG-индуцируемой экспрессионной кассеты Fur в плазмиде, совместимой с pMccE492 или pJAM434 (позволяющей продуцировать MccE492 с разной степенью антибактериальной активности), фрагмент ПЦР размером ~ 2,5 т.п.н., содержащий эту кассету, и lacI q (lac-репрессор) амплифицировали из pFur с использованием праймеров LACLG_ASKA_F и LACLQ2_ASKA_R и клонировали в EcoRV-сайте pACYC184, разрушая ген устойчивости к тетрациклину.Для создания pT5- mceX была сконструирована и синтезирована кассета экспрессии (Genscript Inc.). Эта кассета содержит консенсусные последовательности, определяющие промотор Т5, сайт связывания рибосомы, кодирующую область mceX и терминатор Т5. После синтеза кассету субклонировали в остов плазмиды p33AM, кодирующей репрессор LacI q .

Определение активности β-галактозидазы

Используемый метод был аналогичен методу, первоначально описанному Миллером [37].Для каждого образца около 2 мл бактериальной культуры собирали в предварительно охлажденную пробирку, измеряли оптическую плотность при 600 нм и среду удаляли центрифугированием. Бактериальные осадки хранили при -80 ° C до обработки. Для определения активности осадки клеток оттаивали на льду и ресуспендировали в 1 мл Z-буфера (60 мМ Na 2 HPO 4 , 40 мМ NaH 2 PO 4 · 2H 2 O, 10 мМ KCl , 1 мМ MgSO 4 · 7H 2 O, 50 мМ β-меркаптоэтанол), инкубировали при 30 ° C в течение 5 мин, а затем 200 мкл ONPG (4 мг / мл в Z-буфере без β-меркаптоэтанола) добавлен стартовый счетчик времени реакции.Когда наблюдался сильный желтый цвет (OD 420 = 0,1–0,5), реакцию останавливали добавлением 500 мкл 1 М Na 2 CO 3 , и регистрировали время, прошедшее с начальной точки. Образцы центрифугировали при 17000 x g в течение 2 минут и измеряли оптическую плотность супернатанта при 420 нм. Активность β-галактозидазы, выраженная в единицах Миллера, рассчитывалась по следующей формуле:

Подготовка белковых экстрактов, SDS-PAGE и иммуноблот

Для препаратов экстракции общего белка количество клеток, эквивалентное OD 600 = 1, собирали в предварительно охлажденную пробирку центрифугированием при 17000 x g в течение 2 минут (4 ° C).Гранулы суспендировали в 100 мкл 1X загрузочного буфера (63 мМ трис-HCl, 10% глицерина, 2% SDS, 0,0025% бромфенолового синего, 5% -меркаптоэтанола, pH 6,8). Перед электрофорезным анализом образцы нагревали до 95 ° C в течение 5 мин. 10 мкл экстрактов анализировали с помощью SDS-PAGE в 15% полиакриламидном геле. Визуализацию белковых полос проводили с помощью обычных процедур окрашивания кумасси синим G25. В качестве альтернативы белки переносили из геля на нитроцеллюлозную мембрану с использованием блока переноса для блоттинга, заполненного буфером для переноса (25 мМ трис-HCl, 190 мМ глицин, 20% метанол), применяя постоянный ток 400 мА в течение 90 мин.Обнаружение иммуноблоттинга выполняли, как сообщалось ранее [17], с использованием антитела против His (Santa Cruz Biotechnology) или антитела против GroEL (Sigma), если требуется, и вторичного антитела, связанного с пероксидазой (Pierce).

Статистический анализ

Статистический анализ для оценки значимости различий, наблюдаемых из наборов данных, показанных на фиг. 3 и 4, был выполнен с использованием двустороннего дисперсионного анализа с использованием теста множественного сравнения Сидака для оценки соответствующих пар условий.Для рисунков 5 и 6 использовался односторонний дисперсионный анализ с тестом множественного сравнения Бонферрони. Все расчеты проводились с помощью программы Graphpad Prism 6.

Результаты

Мотивы, связывающие мех, присутствуют в промоторной области генов созревания микроцина E492

Чтобы оценить возможную Fur-зависимую регуляцию кластера генов MccE492, мы выполнили поиск in-silico предполагаемых мотивов связывания Fur. Используя консенсусную последовательность GATAATGATAATCATTATC, ранее описанную для E . coli [24,38], мы идентифицировали предполагаемые Fur-боксы перед генами mceC , mceD , mceE и mceX (рис. 1A и 1B, красные прямоугольники; рис. 1C). В предыдущей работе мы определили, что гены mceC , mceD и mceE транскрибируются как моноцистронные мРНК, и были определены их сайты начала транскрипции (TSS) [15]. Было обнаружено, что предполагаемые последовательности связывания Fur для этих генов перекрывают промоторный элемент -10 в случае mceE и между -10 и стартовым кодоном для обоих, mceC и mceD .Эти три местоположения совместимы с Fur-боксами, присутствующими в вышестоящих регионах уже охарактеризованных Fur-регулируемых генов [38–39]. С другой стороны, поскольку mceX TSS ранее не был идентифицирован, он был определен в этой работе (рис. 2), что указывает на то, что предполагаемый бокс Fur расположен между -10 и стартовым кодоном этого гена (рис. 1B).

Рис. 1. Функциональные коробки меха расположены выше генов созревания микроцина E492 mceJI .

(A) Анализ последовательности выявил присутствие предполагаемых Fur-боксов в кластере генов MccE492 (красные прямоугольники).Сплошные серые сегменты представляют области кластера, которые были клонированы в соответствующей плазмиде, перечисленной слева, и которые использовались в анализах FurTA, показанных на (D). (B) Нуклеотидная последовательность 5 ’вышележащих областей генов mceC , mceD , mceE и mceX . Экспериментально определенный сайт начала транскрипции для каждого гена обозначен как «+1», а промоторные элементы -35 и -10 показаны зеленым. Идентифицированные предполагаемые меховые коробки закрашены красным.(C) Соответствие нуклеотидной последовательности Fur-боксов, идентифицированных в промоторных областях генов mce C, mceD , mceE и mceX , а также консенсусной последовательности, ранее определенной для E . кишечная палочка . Каждому нуклеотидному основанию был присвоен свой цвет. Процент идентичности каждой коробки Fur с консенсусной последовательностью показан в скобках. Наиболее консервативные положения нуклеотидов E . coli консенсус отмечены звездочками.(D) Результаты анализа FurTA для E . coli Репортерный штамм h2717, трансформированный одной из плазмид, перечисленных в (A), или контрольными плазмидами pHC79 и pACYC184. Красная окраска после выращивания на чашках с агаром MacConkey с добавлением железа указывает на связывание с мехом in vivo .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200835.g001

Рис. 2. Гены mceX , mceJ и mceI транскрибируются как одна мРНК с промотора, расположенного выше mceX . Коробка меховая.

(A) ОТ-ПЦР обнаружение полицистронной мРНК, содержащей mceX , mceJ и mceI . КДНК получали из общей РНК E . клеток coli , трансформированных pJAM229. Ампликоны, происходящие от каждой пары праймеров, представлены на схеме синими пунктирными линиями и отмечены белыми стрелками в соответствующем срезе геля. Тотальную РНК, не подвергшуюся обратной транскрипции, использовали в качестве отрицательного контроля (-), а плазмиду pJAM229 использовали в качестве положительного контроля (+).(B) Анализ 5 ’RACE для определения сайта начала транскрипции единицы mceX / mceJI . Использовали два праймера (синие стрелки), один гибридизировался с mceX , а другой — с mceJ . Полоса 147–190 п.н. была обогащена после обработки TAP при использовании праймера mceX (оранжевая стрелка). Полосы, не обогащенные после обработки TAP, также наблюдались с использованием праймеров mceX или mceJ (белые стрелки). Тотальную РНК, не подвергшуюся обратной транскрипции, использовали в качестве отрицательного контроля (-).(C) Две репортерные конструкции были получены путем слияния lacZ с последним кодоном гена mceI . Конструкция mceJI ’-‘ lacZ имеет гавани mceJ , mceX и расположенный выше по течению регион (включая TSS). Конструкция mceJIΔTSS ’-« lacZ »идентична конструкции mceJI’ — «lacZ », за исключением отсутствия области (заштрихованной красным), содержащей промотор mceX и часть его кодирующей области. (D) активность β-галактозидазы измеряли в E . coli клеток трансформировали каждым из репортерных слияний и выращивали до различной оптической плотности. Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению 3 независимых экспериментов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200835.g002

Чтобы получить информацию о функциональности предполагаемых ящиков меха, идентифицированных внутри генетического кластера MccE492, мы оценили их способность связывать мех in vivo с использованием Метод титрования меха (FurTA) описан ранее [36].Для этого сегмент ДНК, содержащий один или несколько тестируемых Fur-боксов, клонировали в многокопийную плазмиду, а затем трансформировали в репортерный штамм h2717, несущий хромосомно-кодируемое слияние промотора fhu F (регулируется Fur ) и ген lac Z. Когда этот репортерный штамм трансформируют плазмидой, несущей функциональный бокс Fur, Fur титруют с промотора fhu F. Следовательно, экспрессируется lacZ , и колонии визуализируются как красные при выращивании на чашках с агаром MacConkey с добавлением железа.Если в анализируемом сегменте ДНК отсутствует функциональный элемент, связывающий Fur, экспрессия lacZ остается подавленной, и трансформированный репортерный штамм не окрашивается в красный цвет. Сплошные серые линии на рис. 1А представляют сегменты ДНК из кластера MccE49, которые были клонированы и трансформированы в репортерный штамм h2717, некоторые из них несут предполагаемые блоки Fur (красные квадраты). После выращивания на чашках с агаром MacConkey с добавлением железа оценивали красную окраску штаммов, несущих каждый сегмент (рис. 1D).Только сегменты, несущие коробки Fur, расположенные в межгенной области mce E / mce X, показали, что они связывают Fur in vivo . Не наблюдалось красной окраски ни с пустыми плазмидными векторами (pACYC184 и pHC79), ни с плазмидами, несущими сегменты ДНК из других областей кластера MccE492, включая те, которые содержат предполагаемые блоки Fur, расположенные выше генов mce C и mce D. . Таким образом, регулятор Fur связывает in vivo с областью выше mce X, что предполагает роль этого регулятора в контроле экспрессии mceX и, возможно, mceJI .Соответственно, выравнивание Fur-боксов, идентифицированных в генетическом кластере MccE492, показало, что mceX и mceE Fur-боксы показали наивысшую идентичность с консенсусом E . coli последовательность (рис. 1C). Более того, mceX Fur box показал 100% консервативность в положениях нуклеотидов, которые, как предполагается, являются наиболее важными для связывания регулятора Fur в Fur-репрессированных генах [25].

Организация транскрипционных единиц, содержащих гены созревания микроцина E492

В предыдущей работе с использованием плазмиды pJAM434 был сделан вывод, что гены созревания mceJI транскрибируются вместе с генами экспорта mceGH [15,40].Однако в последнее время было отмечено, что pJAM434 содержит мутантную версию кластера генов MccE492 с инвертированным фрагментом Xho I размером 6,8 т.п.н. по сравнению с ориентацией дикого типа (рассмотрено в [3] и подтверждено после K pneumoniae секвенирование генома RYC492 [41]). Эта инверсия отделяет гены mceJI от их естественной 5 ’вышележащей области, которая содержит по крайней мере две особенности: mceX и коробку Fur, расположенную перед mceX , идентифицированную в этом исследовании.Следовательно, необходимо было пересмотреть структуру транскрипционной единицы mceJI и ее промоторной области. Вероятно, если бы гены созревания mceJI были транскрибированы вместе с mceX , идентифицированный функциональный блок Fur мог бы контролировать экспрессию всех из них. При поиске in silico не было обнаружено предполагаемых промоторных элементов в области между mceX и mceJ , в то время как предполагаемые элементы -10 / -35 были обнаружены в области 47-86 п.н. выше стартового кодона mceX . .Чтобы продемонстрировать важность этой области в управлении транскрипцией mceX и ее возможном связывании с mceJI , мы сначала провели поиск такой полицистронной мРНК с помощью анализа RT-PCR (рис. 2A). Для этой цели суммарную РНК экстрагировали из E . Хозяин coli , трансформированный плазмидой pJAM229, содержащей кластер генов продуцирования микроцина (в ориентации дикого типа ), которую использовали для синтеза кДНК путем обратной транскрипции.Затем с помощью различных наборов олигонуклеотидных праймеров, направленных на mceX , mceJ и mceI , мы смогли амплифицировать сегменты кДНК, несущие части как mceX / mceJ , так и mceI / mcoding областей. . Результаты, показанные на фиг. 2A, показывают, что mceX транскрибируется, и транскрипт распространяется вниз по течению, включая кодирующие области mceJ и mceI .

Затем мы определили сайт начала транскрипции мРНК mceX mceJI , используя стратегию 5’RACE [35].В этом методе первичные транскрипты могут быть обогащены процессированными или деградированными мРНК с использованием пирофосфатазы табачной кислоты (TAP), которая гидролизует трифосфатный фрагмент, присутствующий только в первичных транскриптах, с образованием 5′-фосфатного конца, который позволяет лигировать Адаптер РНК известной последовательности к этой мРНК. После лигирования адаптера РНК ретранскрибируется с использованием случайных гексамеров, и полученные кДНК используются в качестве матрицы для амплификации ПЦР с адаптером-направленным праймером и вторым праймером, специфичным для транскрипта, TSS которого определяется.ПЦР-ампликоны разделяются электрофорезом в агарозном геле, и первичный транскрипт может быть идентифицирован как полоса, которая обогащается после обработки ТАР. Эта положительная полоса очищается и секвенируется, определяя первое основание рядом с адаптером (соответствующее TSS). Эксперимент проводился с РНК, выделенной из E . coli трансформировали pJAM229 с использованием двух праймеров: один гибридизирует 86 п.н. перед предполагаемым стартовым кодоном mceX , а другой 253 п.н. ниже стартового кодона mceJ (рис. 2В, вверху).После ПЦР-амплификации и гель-электрофореза наблюдалась пара полос для праймеров mceX и mceJ (рис. 2B, внизу). Среди них ампликон длиной 147–190 пар оснований, происходящий из праймера mceX (оранжевая стрелка), был обогащен после обработки TAP и считался положительным для анализа 5’RACE. Анализ последовательности этой полосы показал, что TSS соответствует «A», 42 п.н. перед стартовым кодоном mceX и 288 п.н. перед стартовым кодоном mceJ (фиг. 1B).Исходя из этого, выведенные сайты -10 и -35 напоминают консенсус α 70 для этих элементов и находятся рядом с положением, предсказанным биоинформатически. С праймером mceJ мы наблюдали слабую полосу размером 500-700 п.о., которая соответствует ожидаемому расстоянию до mceX TSS, описанного выше (563 п.о.). Неожиданно оказалось, что эта полоса отрицательна для обогащения ТАП. Этот результат можно объяснить как следствие большого размера ампликона, что нежелательно для оценки TSS с помощью этого метода [34].Второй ампликон, также очень слабый, был получен с праймером mceJ и может считаться положительным для обогащения TAP. Это указывает на возможность второго TSS, расположенного в кодирующей области mceJ . Однако ни предполагаемые последовательности связывания рибосом, ни сайты начала трансляции не могут быть идентифицированы ниже этого предполагаемого TSS.

Для оценки функциональности предполагаемого вторичного TSS и проверки TSS mceX , идентифицированного как первичный стартовый сайт, мы построили два репортерных слияния: mceJI ‘-‘ lacZ и mceJIΔTSS ‘-‘ lacZ (рис. 2C). .Первый содержит сегмент ДНК, содержащий 490 п.н. перед стартовым кодоном mceJ (включая первичный TSS, Fur box и mceX ), ген mceJ и lacZ , слитый с последним кодоном mceI . Последний имеет те же элементы, за исключением делеции, которая начинается на 189 п.н. выше стартового кодона mceJ , устраняя почти половину кодирующей области mceX , блок Fur и первичный TSS. Обе конструкции трансформировали в E . coli и активность LacZ измеряли по росту бактерий в качестве меры экспрессии mceX / mceJI (рис. 2D). Здесь уровни экспрессии этих генов снизились почти до предела обнаружения на всех фазах роста, когда область, включающая первичный TSS, была удалена. Эти данные подтверждают, что TSS mceX является первичным сайтом начала транскрипции для единицы mceX mceJI , и что предполагаемый вторичный TSS малоактивен в наших экспериментальных условиях.

Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что mceX и гены созревания mceJI транскрибируются совместно с общим TSS, расположенным выше функционального Fur-бокса.

Экспрессия

mceX и mceJI , но не mceC , регулируется доступностью железа через мехзависимый механизм

Чтобы исследовать роль доступности железа и меха в регуляции экспрессии mceX и mceJI , мы построили репортерные слияния mceX ’-‘ lacZ и mceJ17 ’-‘ lacZ .Первый включает промоторную область mceX (включая первичный TSS и Fur-бокс) и lacZ , слитый с последним кодоном кодирующей области mceX (рис. 3A), тогда как последний включает промотор и кодирующую область mceX и lacZ слились с семнадцатым кодоном mceJ (фиг. 3B). Ячейки Е . coli MC4100 или его Δ fur производный штамм h2941, были трансформированы слияниями mceX ‘-‘ lacZ или mceJ17 ‘-‘ lacZ (клонировано в p mceX lacZ — lacZ — lacZ и p mceJ17 ‘-‘ lacZ соответственно).Активность LacZ измеряли во время роста бактерий при депривации железа (100 мкМ 2,2’-бипиридил, BIP) или при высокой доступности железа (10 мкМ FeSO 4 ) (фиг. 3). Оба слияния показали сходный паттерн экспрессии в штамме дикого типа с более высокой активностью LacZ в присутствии хелатора железа BIP. В присутствии железа такая активность снижалась до ~ 70% в ранней экспоненциальной фазе роста и до ~ 55-60% в поздней экспоненциальной и стационарной фазах. Напротив, репрессивный эффект железа на экспрессию обоих репортерных слияний не наблюдался в Fur-дефектном штамме (рис. 3), что дает дополнительные доказательства роли этого регулятора в железо-опосредованном контроле mceX mceJI. Экспрессия гена .Кроме того, сверхэкспрессия Fur приводила к значительному снижению репортерной активности как в штаммах wt, так и в Δ fur (не показано).

Рис. 3. Экспрессия генов созревания mceX и микроцина E492 mceJI регулируется наличием меха и железа.

wt и Δ мех E . клеток coli , трансформированных репортерами p mceX ‘-‘ lacZ (A) или p mceJ17 ‘-‘ lacZ (B), выращивали в среде M9 с добавлением 100 мкМ 2,2′- Бипиридил (низкая доступность железа) или 10 мкМ FeSO 4 (высокая доступность железа).Активность β-галактозидазы (выраженная в единицах Миллера) измеряли на разных фазах роста (ранняя экспоненциальная, OD 600 = 0,4–0,6; поздняя экспоненциальная, OD 600 = 0,9-1,1; стационарная, OD 600 = 1,9. –2,1). На схемах построения оранжевый кружок представляет экспериментально определенный сайт начала транскрипции, а красный квадрат представляет функциональный блок Fur. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение между 6 независимыми экспериментами. *** P <0.001, **** P <0,0001, нс: не имеет значения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200835.g003

Предыдущие сообщения показали, что экспрессия iroB , гомолога mceC , регулируется Fur [29,42]. Хотя предполагаемый меховой ящик с 58% идентичностью с E . Было обнаружено, что консенсус coli перекрывает элемент -10 промоторной области mceC , анализы Fur-TA показали, что этот элемент не может связывать Fur in vivo (рис. 1D).Однако эти анализы не являются количественными, и нельзя исключать возможность низкоаффинного связывания Fur с Fur box mceC . Чтобы подтвердить, что Fur не регулирует экспрессию гена mceC , мы трансформировали штаммы wt и Δ fur конструкцией, содержащей lacZ , слитый с последним кодоном гена mceC ( mceC ‘-‘ lacZ ), измеряя активность β-галактозидазы в процессе роста (S1 фиг.). Экспрессия mceC оставалась неизменной на разных стадиях роста как у штаммов wt , так и у Δ fur , и активность, измеренная в соответствующих хозяевах, не показала значимых различий.Таким образом, мы заключаем, что Fur не регулирует экспрессию mceC , вероятно, потому, что он неспособен связываться с предполагаемым mceC Fur box in vivo .

MceX — регулятор, который действует, подавляя экспрессию структурного гена MccE492 и его белка иммунитета

Результаты, представленные выше, показывают, что ранее не охарактеризованный ген mceX транслируется, и что его экспрессия модулируется доступностью железа в Fur-зависимом механизме.Однако его роль в производстве MccE492 неизвестна. Согласно прогнозу in-silico , MceX будет иметь лейциновую молнию и один трансмембранный домен, который также присутствует в его гомологе MchX (68% сходства) из системы microcin h57 (Mcch57) [43]. Функция MchX также неизвестна, и его генетическая организация в системе Mcch57 отличается от MccE492: в то время как в Mcch57 ген mchX кодируется в опероне, содержащем структурные гены и гены иммунитета mchBI , в MccE492 находится в оперон, кодирующий гены созревания mceJI .Было продемонстрировано, что экспрессия mchX находится под Fur репрессией [6] и может действовать как регулятор экспрессии структурного гена Mcch57 [43]. Учитывая сходство между MceX и MchX, мы оценили, действует ли MceX, регулируя экспрессию структурного гена MccE492 mceA . Ранее мы показали, что mceA и mceB образуют единую транскрипционную единицу ( mceBA ), где перекрываются 14 нуклеотидов обеих кодирующих областей, и какой промотор расположен выше mceB [40].Чтобы исследовать влияние железа и MceX на экспрессию этой транскрипционной единицы, мы сконструировали репортерный гибрид mceBA ‘-‘ lacZ , состоящий из промоторной области mceBA и LacZ, слитого с последней аминокислотой. остаток белка MceA. Таким образом, экспрессия этого слияния зависит главным образом от единичного промотора и сайта связывания рибосомы (RBS) mceA . Сначала мы оценили, оказывает ли доступность железа прямое влияние на экспрессию mceBA , измеряя активность LacZ дикого типа или Δ fur E .Клетки coli , несущие слияние mceBA ’-‘ lacZ , при депривации железа или при высокой доступности железа (рис. 4A). В соответствии с отсутствием функционального Fur-бокса в его промоторной области (фиг. 1), экспрессия mceBA оказалась независимой от доступности железа и присутствия регулятора Fur.

Рис. 4. MceX отрицательно регулирует экспрессию структурного гена микроцина E492.

(A) wt и Δ fur E . клеток coli , трансформированных репортером p mceBA ‘-‘ lacZ , выращивали в среде M9 с добавлением 100 мкМ 2,2′-бипиридила (низкая доступность железа) или 10 мкМ FeSO 4 (высокая доступность железа) . Активность β-галактозидазы (выраженная в единицах Миллера) измеряли на разных фазах роста (ранняя экспоненциальная, OD 600 = 0,4–0,6; поздняя экспоненциальная, OD 600 = 0,9–1,1; стационарная, OD 600 = 1,9–1,9–2). 2.1). На схеме конструкции оранжевый кружок представляет ранее определенный сайт начала транскрипции.(B) Дикий тип E . Клетки coli трансформировали pT5- mceX (позволяя IPTG-индуцируемую экспрессию MceX) или плазмидой остова pUC57 в качестве отрицательного контроля. Активность выражали как процент активности β-галактозидазы после индукции по отношению к отрицательному контролю. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение между 6 независимыми экспериментами. *** P <0,001, **** P <0,0001, нс: не значимо.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0200835.g004

Затем мы оценили прямое влияние MceX на выражение слияния. Для этого мы трансформировали E дикого типа. клеток coli , несущих p mceBA ’-‘ lacZ с pT5- mceX , совместимой плазмидой, которая обеспечивает индуцируемую IPTG экспрессию mceX . Активность LacZ измеряли через 2, 4 и 8 ч после индукции и сравнивали с таковой, зарегистрированной для E . клеток coli , несущих p mceBA ’-‘ lacZ плюс контрольную плазмиду (фиг. 4B).Сверхэкспрессия MceX приводила к значительному снижению уровней LacZ во все время оценки, указывая на то, что этот белок эффективно действует как негативный регулятор экспрессии mceBA .

Fur и MceX модулируют антибактериальную активность

E . coli клеток, несущих производственные системы MccE492

Результаты, описанные выше, продемонстрировали, что экспрессия генов mceX и mceJI подавляется увеличением концентрации железа по Fur-зависимому механизму.Токсическая активность MccE492 требует посттрансляционного присоединения сальмохелин-подобной части в реакции, катализируемой продуктами гена MceJI. Следовательно, сверхэкспрессия Fur должна приводить к снижению антибактериальной активности E . coli клеток, продуцирующих MccE492. Чтобы проверить эту гипотезу, мы сконструировали плазмиду p15A- fur , производную pACYC184, несущую 6XHis-меченный ген fur под контролем промотора Т5. Эта плазмида обеспечивает индуцируемую IPTG экспрессию Fur и совместима с pMccE492.Дикий тип E . Клетки coli , несущие pMccE492, трансформировали либо p15A- fur , либо pACYC184 (контроль). После трансформации мы подтвердили сверхэкспрессию Fur в клетках, несущих плазмиду p15A- fur , выращивая их в жидкой среде до экспоненциальной фазы и индуцируя экспрессию с помощью IPTG. Экстракты общего белка были приготовлены через 3 и 24 часа индукции и проанализированы с помощью SDS-PAGE (фиг. 5A). Полоса белка ~ 17 кДа, совместимая с ранее определенной молекулярной массой Fur (16.8 кДа) [44–45], был обогащен образцами, обработанными IPTG. Иммуноблот-анализ с использованием антитела против 6XHis-tag подтвердил, что обогащенная полоса соответствует белку Fur, экспрессируемому из p15A- fur . Хотя в гораздо меньшей степени, этот белок также был обнаружен в неиндуцированных образцах, что указывает на некоторую неплотную экспрессию промотора Т5 (более очевидную через 24 часа после индукции).

Рис. 5. Сверхэкспрессия меха снижает антибактериальную активность E . coli клеток, несущих кластер генов для продукции микроцина E492.

E . coli клеток, несущих pMccE492 (позволяющих продуцировать активный MccE492), трансформировали p15A- fur (управляя сверхэкспрессией Fur, несущего His-tag) или pACYC184 (контроль). (A) Два репрезентативных клона клеток, содержащих p15A- fur , выращивали в среде М9 отдельно или с добавлением IPTG (1 мМ), и экстракты общего белка получали через 3 и 24 часа роста. SDS-PAGE анализ экстрактов с последующим окрашиванием кумасси синим выявил полосу белка ~ 17 кДа, в значительной степени обогащенную клетками, выращенными в присутствии IPTG (черная стрелка).Иммуноблоттинг с использованием антитела против His подтвердил индукцию экспрессии Fur в присутствии IPTG, хотя базальная экспрессия была обнаружена через 24 часа роста в отсутствие индуктора. (B) Антибактериальная активность E . клеток coli , продуцирующих MccE492, трансформированных p15A- fur или контрольной плазмидой (pACYC184). Антибактериальную активность измеряли как функцию площади ореола ингибирования роста над слоем чувствительного штамма в среде M9 с добавлением IPTG, а затем нормализовали до значения, полученного в контрольных условиях (остов плазмиды).Планки погрешностей показывают стандартное отклонение от 40 измерений, выполненных для каждого условия. *** P <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200835.g005

Чтобы проверить влияние сверхэкспрессии Fur на активность MccE492, несколько колоний каждого штамма (несущие pMccE492 плюс p15A- fur или контрольную плазмиду) были вонзили в газон с верхним агаром MccE492-чувствительный E . coli клеток в присутствии IPTG. После инкубации в течение ночи при 37 ° C антибактериальную активность измеряли как функцию площади ореолов ингибирования роста, создаваемых каждой колонией (фиг. 5B).Антибактериальная активность была значительно снижена в клетках, сверхэкспрессирующих Fur, по сравнению с клетками, несущими контрольную плазмиду. Эти результаты показывают, что Fur ингибирует продукцию зрелого MccE492, и это можно объяснить, по крайней мере частично, подавлением экспрессии mceJI .

Вторая регуляторная цепь, связывающая производство MccE492 и доступность железа, будет результатом действия MceX на экспрессию единицы mceBA . Таким образом, мы проверили влияние сверхэкспрессии MceX на продукцию активного MccE492.С этой целью мы преобразовали E . coli , несущие системы продуцирования MccE492 pMccE492 или pJAM434, с совместимой плазмидой pT5- mceX . pMccE492 содержит все гены, необходимые для продукции активного MccE492, присутствующего в K . pneumoniae хромосома RYC492, продуцирующая высокую активность этого микроцина. С другой стороны, pJAM434 также позволяет продуцировать активный MccE492, но из-за инверсии сегмента ДНК, содержащего mceX и гены созревания, производит усеченную версию MceX и низкую экспрессию других генов, что приводит к плохой продуцирующий штамм [17].Клетки, трансформированные каждой парой плазмид (pT5- mceX плюс pMccE492 или pJAM434), помещали в чашки с агаром с добавлением IPTG, содержащие лужайку MccE492-чувствительного штамма. Антибактериальную активность измеряли как функцию площади ореолов ингибирования роста, генерируемых каждой колонией, которая была нормализована по активности, зарегистрированной для контрольной плазмиды в каждом случае (фиг. 6). Сверхэкспрессия MceX в клетках, несущих pMccE492, вызвала небольшое снижение антибактериальной активности (незначительное), предполагая, что белка MceX, продуцируемого из pMccE492 дикого типа, достаточно для репрессивного эффекта и, таким образом, маскирует эффект белка, экспрессируемого из индуцибельной плазмида pT5- mceX .Напротив, когда MceX сверхэкспрессируется в клетках, несущих систему pJAM434 (несущих разрушенную копию mceX ), мы наблюдали значительное снижение антибактериальной активности по сравнению с клетками, трансформированными контрольной плазмидой. Эти результаты согласуются с ролью MceX в подавлении экспрессии структурного гена MccE492.

Рис. 6. Сверхэкспрессия MceX снижает антибактериальную активность E . coli клеток, несущих кластер генов для продукции микроцина E492.

E . Клетки coli , несущие pMccE492 (вес, желтый) или pJAM434 (плохо продуцирующий, зеленый), трансформировали pT5- mceX (управляя сверхэкспрессией MceX) или pUC57 (контроль). Антибактериальную активность измеряли как функцию площади ореола ингибирования роста над слоем чувствительного штамма в среде M9 с добавлением IPTG и нормализовали к значению, полученному в контрольных условиях для каждого случая. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение от 40 измерений, выполненных для каждого условия.** P <0,01, нс: не значимо.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200835.g006

Discussion

Доказательства, представленные в этом исследовании, указывают на то, что метаболизм железа и созревание MccE492 являются процессами, координируемыми координированно. Экспрессия двух основных компонентов посттрансляционной модификации MccE492, MceJ и MceI, и, таким образом, количество продуцируемого активного MccE492 модулируется в ответ на доступность железа за счет действия регулятора поглощения трехвалентного железа Fur.Более того, наши результаты показывают, что поступление железа также оказывает косвенный контроль экспрессии структурного гена MccE492 через действие негативного регулятора MceX.

Несмотря на это, схема была изучена в E . Хозяин coli и продуцирующий кластер MccE492 были первоначально выделены из штамма Klebsiella pneumoniae , различные свидетельства подтверждают, что выводы, полученные здесь, также будут действительными для Klebsiella .Во-первых, несколько примеров Fur-регулируемых генов, включая некоторые, связанные со сборкой фимбрий 3-го типа и биосинтезом капсулярных полисахаридов, были описаны в различных изолятах Klebsiella pneumoniae [46-50]. Кроме того, поиск гена fur в K . Геном pneumoniae RYC492 [41] показал, что присутствует полноразмерная кодирующая область fur . Эта ORF кодирует белок Fur из 150 аминокислот с 96% идентичностью E . coli Fur (148 аминокислот). Высокий уровень идентичности совместим с привязкой E . coli и K . pneumoniae Мех по тем же элементам ДНК.

Поиск ящиков меха вдоль генетического кластера MccE492 выявил присутствие нескольких предполагаемых элементов ДНК с более чем 50% идентичностью с E . coli Fur box консенсус, расположенный в промоторной области генов mceC , mceD , mceE и mceX / mceJI .Однако анализы FurTA показали, что только коробки Fur из межгенной области между mceE и mceX связывают Fur in vivo . Это коррелирует с тем фактом, что коробки mceE и mceX показали самую высокую идентичность с E . coli консенсус (68% и 74% соответственно), тогда как те из генов mceC и mceD показали 58% и 63% идентичности, соответственно. Кроме того, mceX Fur box содержит все восемь наиболее консервативных оснований, определенных для этого сайта связывания, которые, как предполагается, являются основными детерминантами связывания регулятора Fur в E . coli [25, 51].

Исследования ОТ-ПЦР показали, что транскрипция генов mceJI связана с mceX и, таким образом, регулируется Fur через mceX Fur box. Это первое исследование, подтверждающее экспрессию этой ORF, которая имеет гомологи в других кодируемых хромосомами системах микроцинов [6,43]. Используя слияния LacZ , мы подтвердили, что эта ORF транслируется и что ее сверхэкспрессия привела к значительному снижению экспрессии генов mceBA .Чтобы еще раз подтвердить, что снижение активности LacZ, наблюдаемое после избыточной продукции MceX, не связано с титрованием механизмов транскрипции / трансляции при сверхэкспрессии любого гена, мы попробовали влияние сверхэкспрессии MceX на его собственный синтез, и мы не обнаружили никаких результатов. эффект (S2 Рис). Более того, мы показали, что сверхэкспрессия MceX снижает антимикробную активность MccE492-продуцирующего E . coli клеток. Роль MceX согласуется с функцией MchX (гомолог MceX в системе микроцина h57), который, как предполагалось, регулирует структурный ген Mcch57.Здесь mchX имеет функциональный Fur-бокс в своей промоторной области, который обеспечивает Fur-зависимую репрессию этого гена при высоких концентрациях железа [6]. Это было предложено как объяснение того, почему активное производство Mcch57 низкое, когда железа много. Однако в этой системе mchX , по-видимому, совместно транскрибируется с непосредственно расположенными ниже генами mchI и mchB , кодирующими иммунитет к микроцину h57 и белок бактериоцин, соответственно [43]. Гены посттрансляционной модификации mchC и mchD (82% и 95% сходства с mceJ и mceI соответственно) лежат на 270 п.н. ниже mchB .Нарушение гена mchX вставками транспозонов вызвало снижение активности Mcch57. Хотя механизм, лежащий в основе такого эффекта, напрямую не изучался, на основе анализа нескольких мутантов было предложено, что i) mchX транскрибируется по крайней мере с одним геном, который участвует в продукции Mcch57, поэтому вставка транспозона в mchX нарушает поток транскрипции через нижестоящие гены и / или ii) MchX выполняет регуляторную роль, действуя как активатор некоторых генов продукции Mcch57 и индуцируя собственную экспрессию [43].Следовательно, зависимая от железа Fur-опосредованная репрессия транскрипции mchX должна вызывать снижение активности Mcch57 путем подавления по крайней мере гена mchB . Поскольку экспрессия катехоловых рецепторов сильно индуцируется при низком уровне железа, Патцер с соавторами [6] предположили, что индукция продукции Mcch57 в условиях низкого содержания железа может быть механизмом отбора против бактерий, конкурирующих за один и тот же сидерофор. Однако для того, чтобы этот механизм был эффективным, продукция активного Mcch57 при низких концентрациях железа должна требовать также активации генов созревания, как было продемонстрировано в системе MccE492.Соответственно, регуляторный эффект уровней железа и Fur на экспрессию генов созревания Mcch57 нельзя отбросить, поскольку возможно, что полицистронный транскрипт, содержащий mchXIB , выходит за рамки включения генов mchC и mchD , помещая их под контроль мчХ Ящик меховой.

Что касается гена созревания mceC , хотя предполагаемый Fur-бокс был идентифицирован в его промоторной области, анализ FurTA исключил связывание in vivo этого регулятора.Соответственно, профиль конститутивной экспрессии наблюдали с использованием слияния mceC ’-‘ lacZ , и никаких различий не наблюдалось при сравнении уровней экспрессии на фоне wt и Δ fur . Напротив, уровни железа (за счет действия Fur) регулируют экспрессию mceC , гомолога iroB из Salmonella enterica [29]. Это указывает на различную эволюционную историю генов гликозилтрансфераз из iroBCDEN и генов, содержащихся в кластерах продукции хромосомных микроцинов, где эта функция не регулируется Fur, как продемонстрировано для MccE492 (это исследование) и Mcch57 [6].Конститутивная экспрессия mceC указывает на то, что продукция сальмохелиноподобных молекул, начиная с энтерохелина, доступна на всех стадиях роста. Это, вероятно, означает конкурентное преимущество для клеток, несущих систему продукции MccE492, поскольку сальмохелин ускользает от связывающего железо белка липокалина, присутствующего в сыворотке крови млекопитающих, который связывает и нейтрализует энтерохелин [20]. В этой строке предыдущие свидетельства указывают на то, что сальмохелин и / или MccE492, вероятно, играют роль в K . pneumoniae патогенез. Во-первых, детерминанты продукции этих молекул были тесно связаны с гипервирулентными штаммами [9–10]. Во-вторых, продуцирующий кластер MccE492 формирует часть нестабильного и, возможно, мобилизуемого геномного островка (несущего предполагаемое происхождение конъюгированного переноса), который в высокой степени ассоциировался со штаммами, выделенными из абсцессов печени [11]. В соответствии с этим в недавней работе мы показали, что K . pneumoniae RYC492 (несущий кластер продукции Mcc492 в своей хромосоме) является высоко вирулентным для личинок рыбок данио и моделей инфекции Dictyostelium discoideum [52].Кроме того, было показано, что гипервирулентные изоляты K1 несут более высокую частоту генов, связанных с производством сальмохелина, среди этнически разнородной популяции, оцениваемой в рамках клинического исследования «Антибиотики для Klebsiella синдром абсцесса печени» (A-KLASS) в Сингапуре [53] . Более того, продукция сидерофоров салмохелина и иерсиниабактина и его взаимодействие с липокалином 2 определяют репликативную нишу Klebsiella pneumoniae на модели пневмонии мышей [54].Однако другие данные, изучающие репертуар сидерофоров этого вида, показали, что аэробактин, но не иерсиниабактин, сальмохелин или энтеробактин, является определяющим для роста и выживания гипервирулентного K . pneumoniae ex vivo и in vivo [55]. Таким образом, необходимы дополнительные исследования, чтобы понять вклад продукции MccE492 и сальмохелина в патогенез этого вида.

С другой стороны, тесты FurTA показали, что существует функциональный Fur-бокс в промоторной области mceE .Значение предполагаемой Fur-опосредованной регуляции гена mceE неясно, поскольку функция белка MceE остается не охарактеризованной. Однако некоторые подсказки возникают из анализа его аминокислотной последовательности. С-концевая часть MceE в некоторой степени идентична MchS4, белку, кодируемому в системе Mcch57, который способствует продукции энтерохелина посредством неизвестного механизма [56]. Следовательно, возможно, что некоторые компоненты систем продуцирования микроцинов, такие как MceE, обеспечивают адекватное поступление энтерохелина для участия в качестве субстрата для созревания микроцина.

Чтобы рассмотреть влияние меха на активное производство MccE492, мы сначала попытались сравнить активное производство MccE492 на фоне wt и Δ fur . Однако несколько попыток не удалось получить клетки Δ fur , трансформированные системами pMccE492 или pJAM229, и мы смогли осуществить трансформацию только с помощью pJAM434, низкопродуцирующего варианта. Это предполагает, что избыточная экспрессия mceJI в отсутствие Fur может быть вредной или токсичной для клеток, продуцирующих MccE492.По этой причине мы попробовали обратное, то есть оценить эффект сверхэкспрессии fur на активную продукцию MccE492. Эти результаты показали, что сверхэкспрессия fur приводила к снижению антибактериальной активности клеток, продуцирующих MccE492. Эти результаты согласуются с выводами Вассилиадиса и др. . [57], которые сообщили об отсутствии продукции зрелого MccE492 при высоких уровнях железа. Этот эффект теперь можно объяснить вкладом по крайней мере двух регуляторных путей.Во-первых, как показано в этой работе, в присутствии железа Fur действует напрямую, подавляя экспрессию генов созревания mceJI , поэтому будет продуцироваться менее зрелый микроцин. Кроме того, при высоких уровнях железа Fur ингибирует биосинтез энтерохелина, связываясь с Fur-боксами, расположенными в промоторе нескольких генов этого пути, и вызывая их репрессию [26,58]. Другими более отдаленными примерами Fur и железо-опосредованной регуляции продукции микроцинов являются колицин V [59] и MccJ25 [60].Депривация железа вызывает продукцию MccJ25, но исследования на меховом фоне все еще демонстрируют некоторую репрессию железом [60]. В случае колицина V транскрипция двух расходящихся оперонов, содержащих гены, необходимые для его продукции, репрессируется с помощью Fur в условиях высоких уровней железа (обзор в [61]). Экспрессия этих генов индуцируется в конце экспоненциальной фазы роста в результате сопутствующего истощения запасов железа [62]. Интересно, что колицин V также требует, чтобы рецептор сидерофоров Cir пересекал внешнюю мембрану, чтобы проявить свой токсический эффект, подтверждая гипотезу о том, что индукция активной продукции микроцина при низких уровнях железа связана с уничтожением бактерий, конкурирующих за одни и те же сидерофоры, как было предложено Патцером и соавторами. [6].

В целом, доказательства, представленные в этой работе, подтверждают модель цепи регуляции железа, контролирующей продукцию, созревание и вероятное образование амилоида MccE492, как показано на рис. 7. Когда железа мало (рис. 7A), Fur-Fe 2+ отсутствует. доступны комплексы, которые могут действовать как репрессоры. Следовательно, Fur не может связывать Fur-боксы, расположенные в промоторах нескольких генов, участвующих в синтезе энтерохелина ( энт генов; «1» на схемах фиг. 7A и 7B), что делает возможным их экспрессию и, таким образом, получение высокой количества энтерохелина.Впоследствии конститутивно экспрессируемый белок MceC катализирует гликозилирование энтерохелина, продуцирующего сальмохелин. Кроме того, Fur неспособен репрессировать гены mceX / mceJI («2» на схемах фиг. 7A и 7B), и, таким образом, MceJ и MceI могут катализировать присоединение сальмохелина к молекулам MccE492. Гены экспорта mceHG являются частью этого оперона и, следовательно, транскрибируются с того же промотора, но также и с независимого промотора, расположенного выше mceH [15], поэтому экспорт MccE492 не является ограничивающим шагом.Кроме того, регулятор MceX снижает экспрессию генов mceBA («3» на схемах фиг. 7A и 7B), ограничивая продукцию незрелого MccE492. В этом сценарии экспортируется высокая доля модифицированного (активного) MccE492, который затем может проникать в периплазму клеток-мишеней через рецепторы катехоловых сидерофоров и оказывать свое токсическое действие. Напротив, при избытке железа (рис. 7B) комплексы Fur-Fe 2+ связываются с меховыми коробками генов ent и mceX / mceJI , снижая их экспрессию.Таким образом, наблюдается низкая продукция энтерохелина и сальмохелина и плохой процесс созревания MccE492. Кроме того, низкая экспрессия негативного регулятора MceX позволяет более высокую экспрессию предшественника MccE492. Следовательно, в основном экспортируется немодифицированный MccE492, который не распознается рецепторами сидерофоров и, следовательно, не вызывает токсического эффекта. Как было показано ранее, модифицированные формы MccE492 имеют пониженную склонность к агрегации по сравнению с немодифицированным пептидом, который является высокоамилоидогенным in vitro [5].Таким образом, возможно, что содержание железа накладывает двойной отрицательный контроль антибактериальной активности MccE492. Во-первых, это неблагоприятно для процесса созревания, а во-вторых, увеличение выработки предшественника MccE492 и, следовательно, соотношения немодифицированных / модифицированных форм, что, в свою очередь, увеличивает склонность к образованию амилоида. Это может быть способом ускорения инактивации токсинов в ответ на увеличение содержания железа.

Рис. 7. Модель регуляторной цепи железа, контролирующей продукцию, созревание и антибактериальную активность микроцина E492.

(A) При низкой доступности железа репрессорные комплексы Fur-Fe 2+ недоступны для связывания Fur box, расположенного в промоторах генов, участвующих в синтезе энтерохелина (1) и mceX / mceJI гены (2). Таким образом, продуцируются большие количества энтерохелина и сальмохелина, а белки MceJI катализируют присоединение сальмохелина к пептиду MccE492 (созревание). Кроме того, регулятор MceX частично репрессирует гены mceBA (3), ограничивая продукцию незрелого MccE492.В этой ситуации экспортируется большая часть модифицированного MccE492, который может проникать в клетки-мишени через рецепторы катехолидерофоров, что приводит к высокой антибактериальной активности. Производство большого количества модифицированного MccE492, вероятно, препятствует его агрегации амилоида, предотвращая инактивацию токсина. (B) При высокой доступности железа комплексы Fur-Fe 2+ репрессируют гены ent и mceX / mceJI , вызывая низкую продукцию энтерохелина и сальмохелина, плохой процесс созревания MccE492 и высвобождение отрицательной регуляции, осуществляемой MceX в отношении генов mceBA , что делает возможной более высокую экспрессию предшественника MccE492.Следовательно, в основном экспортируется немодифицированный MccE492, который не распознается рецепторами сидерофоров и, следовательно, не вызывает токсического эффекта. Высокая доля немодифицированного MccE492, вероятно, способствует его агрегации в амилоидные волокна и, таким образом, потере антибактериальной активности. Схема включает упрощенное представление фактической организации генов и .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200835.g007

Вспомогательная информация

S1 Рис.Мех не регулирует экспрессию

mceC .

E . Клетки coli wt и Δ fur трансформировали репортерным слиянием последнего кодона mceC и lacZ ( mceC ’-‘ lacZ ) и выращивали в среде M9. Оптическая плотность при 600 нм (A) и активность β-галактозидазы (B) были измерены для каждого условия в разное время и в разные фазы роста (ранняя экспонента, OD 600 = 0,40–0.6; Поздняя экспонента, OD 600 = 0,9–1,1; Стационарный, OD 600 = 1,9–2,1). Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению трех независимых экспериментов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200835.s001

(PDF)

S2 Рис. Влияние сверхэкспрессии MceX на активность LacZ клеток, несущих слияние

mceX ’-‘ lacZ .

E . Клетки coli , несущие плазмиду, несущую ген lacZ, слитый с первым кодоном mceX , трансформировали совместимой плазмидой pT5- mceX , обеспечивая индуцируемую IPTG экспрессию mceX .Активность LacZ измеряли для клеток, растущих в присутствии 1 мМ IPTG или без IPTG, на разных фазах роста. Сверхэкспрессия mceX не влияла на активность LacZ слияния mceX ’-‘ lacZ . Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению трех независимых экспериментов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200835.s002

(PDF)

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами 1100141 и 1140430 от Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDECYT).Мы очень благодарны доктору Й. Фогелю (Университет Вюрцбурга, Германия) за получение S.G-C. в своей лаборатории, где он провел определения 5´RACE. Мы также благодарим Беатрис Гонсалес за создание pMccE492. С. Гутьеррес-Кортес получил докторскую стипендию DAAD, и его пребывание в лаборатории доктора Фогеля также финансировалось DAAD.

Ссылки

  1. 1. de Lorenzo V. Выделение и характеристика микроцина E492 из Klebsiella pneumoniae . Arch Microbiol.1984. 139: 72–75. pmid: 6385903
  2. 2. Lagos R, Wilkens M, Vergara C, Cecchi X, Monasterio O. Микроцин E492 образует ионные каналы в фосфолипидных двухслойных мембранах. FEBS Lett. 1993. 321: 145–148. pmid: 7682973
  3. 3. Lagos R, Tello M, Mercado G, García V, Monasterio O. Антибактериальные и противоопухолевые свойства микроцина E492, порообразующего бактериоцина. Curr Pharm Biotechnol. 2009; 10: 74–85. pmid: 1
  4. 91
  5. 4. Bieler S, Estrada L, Lagos R, Baeza M, Castilla J, Soto C.Образование амилоида модулирует биологическую активность бактериального белка. J Biol Chem. 2005; 280: 26880–26885. pmid: 15

    5

  6. 5. Marcoleta A, Marín M, Mercado G, Valpuesta JM, Monasterio O, Lagos R. Образование амилоида Microcin E492 задерживается посттрансляционной модификацией. J Bacteriol. 2013; 195: 3995–4004. pmid: 23836864
  7. 6. Патцер С.И., Бакеро М.Р., Браво Д., Морено Ф., Хантке К. Детерминанты колицина G, H и X кодируют микроцины M и h57, которые могут использовать рецепторы катехолатных сидерофоров FepA, Cir, Fiu и IroN.Микробиология. 2003. 149: 2557–2570. pmid: 12949180
  8. 7. Hantke K, Nicholson G, Rabsch W., Winkelmann G. Салмохелины, сидерофоры Salmonella enterica и уропатогенные штаммы Escherichia coli распознаются рецептором внешней мембраны IroN. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 3677–3682. pmid: 12655053
  9. 8. Strahsburger E, Baeza M, Monasterio O, Lagos R. Совместное поглощение микроцина E492 рецепторами FepA, Fiu и Cir и ингибирование сидерофором энтерохелином и его димерными и тримерными продуктами гидролиза.Антимикробные агенты Chemother 2005; 49: 3083–3086. pmid: 15980406
  10. 9. Holt KE, Wertheim H, Zadoks RN, Baker S, Whitehouse CA, Dance D, et al. Геномный анализ разнообразия, структуры популяции, вирулентности и устойчивости к противомикробным препаратам у Klebsiella pneumoniae , неотложной угрозы общественному здоровью. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2015; 112 (27): E3574–81. pmid: 26100894
  11. 10. Струве С., Роу С.С., Стеггер М., Штальхут С.Г., Хансен Д.С., Энгельталер Д.М. и др.Картирование эволюции гипервирулентности Klebsiella pneumoniae . MBio 2015; 6 (4): e00630. pmid: 26199326
  12. 11. Marcoleta AE, Berríos-Pastén C, Nuñez G, Monasterio O, Lagos R. Klebsiella pneumoniae тДНК аспарагина являются горячими точками интеграции для различных геномных островов, кодирующих детерминанты продукции микроцина E492 и другие предполагаемые факторы вирулентности, присутствующие в гипервирулентных штаммах. Front Microbiol. 2016; 7: 849. pmid: 27375573
  13. 12. Клегг С., Мерфи CN. Эпидемиология и вирулентность Klebsiella pneumoniae . Microbiol Spectrum 2016; 4: UTI-0005-2012.
  14. 13. Paczosa MK., Mecsas J. Klebsiella pneumoniae : переход в нападение с сильной защитой. Microbiol Mol Biol Rev.2016; 80: 629–661. pmid: 27307579
  15. 14. Вилкенс М., Вильянуэва Дж. Э., Кофре Дж., Чнайдерман Дж., Лагос Р. Клонирование и экспрессия в Escherichia coli генетических детерминант продукции и иммунитета к микроцину E492 из Klebsiella pneumoniae .J. Bacteriol. 1997; 179: 4789–4794. pmid:

    66

  16. 15. Lagos R, Baeza M, Corsini G, Hetz C, Strahsburger E, Castillo JA, Monasterio O. Структура, организация и характеристика кластера генов, участвующих в производстве микроцина E492, каналообразующего бактериоцина. Мол. Microbiol. 2001; 42: 229–243. pmid: 11679081
  17. 16. Нолан Э.М., Фишбах М.А., Коглин А., Уолш СТ. Биосинтетическая адаптация микроцина E492m: посттрансляционная модификация дает антибактериальный конъюгат сидерофор-пептид.J Am Chem Soc. 2007; 129: 14336–14347. pmid: 17973380
  18. 17. Mercado G, Tello M, Marín M, Monasterio O, Lagos R. Производство in vivo микроцина E492 с антибактериальной активностью зависит от сальмохелина и EntF. J Bacteriol. 2008; 190: 5464–5471. pmid: 18502859
  19. 18. Нолан Э.М., Уолш СТ. Исследование MceIJ-катализируемой посттрансляционной модификации С-конца микроцина E492: связывание рибосомных и нерибосомных пептидов с образованием антибиотиков типа «троянский конь».Биохимия. 2008; 47: 9289–9299. pmid: 186
  20. 19. Эндрюс С.К., Робинсон А.К., Родригес-Хинонес Ф. Бактериальный гомеостаз железа. FEMS Microbiol Rev.2003; 27: 215–237. pmid: 12829269
  21. 20. Фишбах М.А., Линь Х., Лю Д.Р., Уолш К.Т. Как патогенные бактерии избегают саботажа млекопитающих в битве за железо. Nat Chem Biol. 2006; 2: 132–138. pmid: 16485005
  22. 21. Хантке К. Регуляция железа и металлов у бактерий. Curr Opin Microbiol 2001; 4: 172–177.pmid: 11282473
  23. 22. Филлат МФ. Суперсемейство FUR (регулятор захвата железа): разнообразие и универсальность ключевых регуляторов транскрипции. Arch Biochem Biophys. 2013; 546: 41–52.
  24. 23. Багг А., Нейландс Дж. Б. Белок регуляции захвата железа действует как репрессор, используя железо (II) в качестве кофактора для связывания оператора оперона транспорта железа в Escherichia coli . Биохимия. 1987; 26: 5471–5477. pmid: 2823881
  25. 24. Эсколар Л., Перес-Мартин Дж., Де Лоренцо В.Связывание репрессора меха (регулятор захвата железа) Escherichia coli с массивами последовательности GATAAT. Дж. Мол Биол 1998; 283: 537–547. pmid: 9784364
  26. 25. Chen Z, Lewis KA, Shultzaberger RK, Ляхов IG, Zheng M, Doan B, Storz G, Schneider TD. Обнаружение кластеров сайтов связывания меха в Escherichia coli с помощью моделей теории информации. Nucleic Acids Res. 2007. 35: 6762–6777. pmid: 173
  27. 26. МакХью Дж. П., Родригес-Хинонес Ф., Абдул-Теграни Х., Свистуненко Д.А., Пул Р.К., Купер К.Э., Эндрюс СК.Глобальная железозависимая регуляция гена в Escherichia coli . Новый механизм гомеостаза железа. J Biol Chem 2003; 278: 29478–29486. pmid: 12746439
  28. 27. Колдервуд С.Б., Мекаланос Дж. Дж. Железная регуляция экспрессии Shiga-подобного токсина в Escherichia coli опосредуется локусом fur. J Bacteriol 1987; 169: 4759–4764. pmid: 3308853
  29. 28. Le Cam E, Frechon D, Barray M, Fourcade A, Delain E. Наблюдение за связыванием и полимеризацией репрессора Fur на ДНК, содержащей оператора, с помощью электронного и атомно-силового микроскопов.Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: 11816–11820. pmid: 79
  30. 29. Баумлер А.Дж., Цолис Р.М., ван дер Фельден А.В., Стойилькович И., Аник С., Хеффрон Ф. Идентификация нового регулируемого железом локуса Salmonella Typhi. Ген 1996; 183: 207–213. pmid: 8996108
  31. 30. Фишбах М.А., Линь Х., Лю Д.Р., Уолш К.Т. In vitro характеристика IroB, патоген-ассоциированной С-гликозилтрансферазы. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102: 571–576. pmid: 15598734
  32. 31.Сэмбрук Дж. И Рассел Д. Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. 3-е изд. Нью-Йорк: Лаборатория издательства Колд-Спринг-Харбор; 2001.
  33. 32. Шнайдер CA, Rasband WS, Eliceiri KW. NIH Image to ImageJ: 25 лет анализа изображений. Нат методы. 2012; 9: 671–675. pmid: 224
  34. 33. Соловьев В., Саламов А. Автоматическая аннотация микробных геномов и метагеномных последовательностей. В: Ли Р. У., редактор. Метагеномика и ее применение в сельском хозяйстве, биомедицине и экологических исследованиях.Издательство Nova Science; 2011. С. 61–78.
  35. 34. Герхарт Э., Вагнер Х., Фогель Дж. Подходы к идентификации новых не-мессенджеров РНК в бактериях и к исследованию их биологических функций: функциональный анализ идентифицированных не-мРНК. В: Hartmann RK, Bindereif A, Schön A и Westhof E, редакторы. Справочник по биохимии РНК. Вайнхайм, Германия: Wiley-VCH Verlag GmbH; 2008.
  36. 35. Urban JH, Vogel J. Контроль трансляции и распознавание цели с помощью малых РНК Escherichia coli in vivo .Nucleic Acids Res. 2007. 35: 1018–1037. pmid: 17264113
  37. 36. Стоилькович И., Баумлер А.Дж., Хантке К. Меховой регулон у грамотрицательных бактерий. Идентификация и характеристика новых регулируемых железом генов Escherichia coli методом титрования шерсти. J Mol Biol. 1994; 236: 531–545. pmid: 8107138
  38. 37. Миллер Дж. Краткий курс бактериальной генетики. Нью-Йорк: Лаборатория издательства Колд-Спринг-Харбор; 1992. С. 71–74.
  39. 38. Лундриган М, Каднер Р.Нуклеотидная последовательность гена рецептора ферриэнтерохелина FepA в Escherichia coli . J Biol Chem. 1986; 261: 10797–10801. pmid: 3015941
  40. 39. де Лоренцо В., Ви С., Эрреро М., Нейландс Дж. Б. Операторные последовательности оперона аэробактина плазмиды ColV-K30, связывающие репрессор регуляции захвата железа (мех). J Bacteriol. 1987. 169: 2624–2630. pmid: 3294800
  41. 40. Corsini G, Baeza M, Monasterio O, Lagos R. Экспрессия генов, участвующих в созревании микроцина, регулирует выработку активного микроцина E492.Биохимия. 2002; 84: 539–544. pmid: 12423798
  42. 41. Марколета А., Гутьеррес-Кортез С., Матурана Д., Монастерио О, Лагос Р. Полногеномная последовательность штамма, продуцирующего микроцин E492, Klebsiella pneumoniae RYC492. Объявление о геноме. 2013; 1: pii: e00178-13.
  43. 42. Фостер JW, зал HK. Влияние мутаций регулятора захвата железа (мех) Salmonella Typhimurium на синтез белка, регулируемый железом и pH. J Bacteriol. 1992; 174: 4317–4323. pmid: 1624426
  44. 43.Родригес Э., Лавинья М. Генетический анализ иммунитета к микроцину h57. Может J Microbiol. 1998. 44: 692–697. pmid: 9783429
  45. 44. Шеффер С., Хантке К., Браун В. Нуклеотидная последовательность регуляторного гена железа fur . Мол Джен Генет 1985; 200: 110–113. pmid: 2993806
  46. 45. Wee S, Neilands JB, Bittner M, Hemming B, Haymore B, Seetharam R. Экспрессия, выделение и свойства белка Fur (регуляция захвата железа) Escherichia coli K12. Биол Металлы 1988; 1: 62–68
  47. 46.Ахенбах Л.А., Ян В. Ген fur из Klebsiella pneumoniae : характеристика, геномная организация и филогенетический анализ. Ген. 1997; 185: 201–207. pmid: 16
  48. 47. Ахенбах Л.А., Генова Э.Г. Регуляция транскрипции второго гена флаводоксина из Klebsiella pneumoniae . Ген. 1997; 194: 235–240. pmid: 65
  49. 48. Цзин-Тинг Л., Цзян-Чен В., Ю-Шэн Ц., И-Чжи Л., Чиа Ц., Цзин-Цяо Л. и др.Меховая регуляция капсульного биосинтеза полисахаридов и систем накопления железа у Klebsiella pneumoniae CG43. Микробиология. 2011; 157: 419–29. pmid: 21071493
  50. 49. Lin CT., Wu CC., Chen YS., Lai YC., Chi C., Lin JC., Et al. Меховая регуляция капсульного биосинтеза полисахаридов и систем накопления железа у Klebsiella pneumoniae CG43. Микробиология. 2011; 157 (Pt 2): 419–29. pmid: 21071493
  51. 50. Wu CC., Lin CT., Cheng WY., Huang CJ., Wang ZC., Peng HL. Мех-зависимая регуляция MrkHI фимбрий 3-го типа у Klebsiella pneumoniae CG43. Микробиология. 2012; 158 (Pt 4): 1045–56. pmid: 22262101
  52. 51. Seo SW, Kim D, Latif H, O’Brien EJ, Szubin R, Palsson BO. Расшифровка сети регуляции транскрипции Fur подчеркивает ее сложную роль помимо метаболизма железа в Escherichia coli . Nat Commun. 2014; 5: 4910. pmid: 25222563
  53. 52. Марколета А.Е., Варас М.А., Ортис-Северин Дж., Васкес Л., Берриос-Пастен С., Сабаг А.В. и др. Оценка различных признаков вирулентности Klebsiella pneumoniae с использованием Dictyostelium discoideum и личинок рыбок данио в качестве моделей-хозяев. Front Cell Infect Microbiol. 2018; 8:30. pmid: 29479519
  54. 53. Ли И.Р., Молтон Дж.С., Вайрес К.Л., Горри С., Вонг Дж., Хох Ч. и др. Факторы дифференцированной восприимчивости хозяина и бактериальной вирулентности, вызывающие абсцесс печени клебсиеллами в этнически разнообразной популяции. Sci Rep.13 июля 2016; 6: 29316.pmid: 27406977
  55. 54. Бахман М.А., Ленио С., Шмидт Л., Ойлер Дж. Э., Вайзер Дж. Н.. Взаимодействие липокалина 2, трансферрина и сидерофоров определяет репликативную нишу Klebsiella pneumoniae при пневмонии. MBio. 2012; 3 (6). pii: e00224-11.
  56. 55. Руссо Т.А., Олсон Р., Макдональд Ю., Бинан Дж., Дэвидсон Б.А. Аэробактин, но не иерсиниабактин, сальмохелин или энтеробактин, способствует росту / выживанию гипервирулентных (гипермуковязких) Klebsiella pneumoniae ex vivo и in vivo.Заражение иммунной. 2015; 83 (8): 3325–33. pmid: 26056379
  57. 56. Аспироз М.Ф., Лавинья М. Участие пути синтеза энтеробактина в продукции микроцина h57. Антимикробные агенты Chemother. 2004. 48: 1235–1241. pmid: 15047525
  58. 57. Vassiliadis G, Peduzzi J, Zirah S, Thomas X, Rebuffat S, Destoumieux-Garzón D. Понимание биосинтеза сидерофор-несущих пептидов: энтеробактин является предшественником посттрансляционной модификации микроцина E492. Антимикробные агенты Chemother.2007; 51: 3546–53. pmid: 17646411
  59. 58. Брикман Т.Дж., Озенбергер Б.А., Макинтош М.А. Регуляция дивергентной транскрипции из чувствительных к железу областей-операторов промотора fepB-entC в Escherichia coli . J Mol Biol. 1990; 212: 669–682. pmid: 2139473
  60. 59. Chehade H, Braun V. Регулируемый железом синтез и поглощение колицина V. FEMS Microbiol. Lett. 1988; 52: 177–182.
  61. 60. Salomón RA, Farías RN. Влияние железа на продукцию микроцина 25.FEMS Microbiol. Lett. 1994; 121: 275–280. pmid: 71
  62. 61. Колтер Р., Морено Ф. Генетика пептидных антибиотиков, синтезированных рибосомами. Annu Rev Microbiol. 1992; 46: 141–163. pmid: 1444252
  63. 62. Бойер А.Е., Тай ПК. Характеристика промоторов cvaA и cvi экспортной системы колицина V: железозависимая транскрипция cvaA модулируется нижестоящими последовательностями. J Bacteriol. 1998; 180: 1662–1672. pmid: 9537361
  64. 63.Casadaban MJ. Транспозиция и слияние генов lac для выбора промоторов в Escherichia coli с использованием бактериофага лямбда и Mu. J Mol Biol. 1976; 104: 541–555. pmid: 781293
  65. 64. Хантке К. Регулирование транспорта трехвалентного железа в Escherichia coli K12: выделение конститутивного мутанта. Mol Gen Genet. 1981; 182: 288–292. pmid: 7026976
  66. 65. Чанг AC, Коэн С.Н. Конструирование и характеристика амплифицируемых носителей многокопийного клонирования ДНК, полученных из криптической миниплазмиды P15A.J Bacteriol. 1978; 134: 1141–1156. pmid: 149110
  67. 66. Kitakawa M, Ara T, Arifuzzaman M, Ioka-Nakamichi T, Inamoto E, Toyonaga H, Mori H. Полный набор клонов ORF Escherichia coli Библиотека ASKA (Полный набор архива ORF E. coli K-12): Уникальные ресурсы для биологических исследований. Исследования ДНК. 2005; 12: 291–299. pmid: 16769691
  68. 67. Хон Б., Коллинз Дж. Маленькая космида для эффективного клонирования больших фрагментов ДНК. Ген. 1980; 11: 291–298.pmid: 6260575
  69. 68. Гонсалес Б. Влияние экспрессии генов mceD, mceF и orfK на штаммы, продуцирующие микроцин E492. M.Sc. Диссертация, Чилийский университет. 2011.
  70. 69. Бароло С., Карвер Л.А., Посаконы Ю.В. Векторы трансформации GFP и бета-галактозидазы для анализа промоторов / энхансеров в Drosophila . Биотехники. 2000. 29: 726–732. pmid: 11056799

Биохимическая характеристика регулятора поглощения железа (Fur) из Aliivibrio salmonicida.Картирование специфичности последовательности ДНК с помощью исследований связывания и структурного моделирования

AsFur очищали до гомогенности с помощью аффинной и эксклюзионной хроматографии

AsFur состоит из 147 аминокислотных остатков с теоретической pI и молекулярной массой 5,75 и 16,6 кДа соответственно. Процедура крупномасштабной очистки AsFur была разработана Pedersen et al. (Педерсен и др., 2010). Вкратце, ген fur из A. salmonicida был клонирован, сверхэкспрессирован в BL21-CodonPlus® (DE3) -RIL и очищен до очевидной гомогенности двумя последовательными стадиями; Аффинная очистка IMAC с использованием HisTrap HP с последующим SEC с использованием HiLoad Superdex 200 мкг.По данным SEC-хроматографии, фракции AsFur были обнаружены в объеме, соответствующем гомодимеру, что согласуется с предыдущими наблюдениями (Pedersen et al. 2010). SDS-PAGE анализ очищенного AsFur показан на фиг. 1.

Рис. 1

SDS-PAGE, окрашенный кумасси синим, показывающий маркер молекулярной массы и фракции, собранные из IMAC и SEC, соответственно. Соответствующие молекулярные массы (Mw; кДа) указаны

Скрининг термической денатурации по pH и соли показал небольшое влияние на стабилизацию меха

Хотя AsFur был очищен до гомогенности, как показано на фиг.1, исходные партии белка показали тенденцию к агрегации с полной потерей связывающей активности в течение недели при стандартных условиях хранения. Чтобы избежать агрегации белков и повысить стабильность, был реализован анализ теплового сдвига (Thermofluor) для определения лучших буферных условий. Скрининг диапазона буферных композиций (и pH) с помощью Thermofluor показал лишь незначительное влияние на стабильность AsFur, однако анализы активности показали, что незначительное изменение pH с 8,0 до 7,5 в Tris-буфере уменьшало агрегацию и увеличивало стабильность AsFur при хранении при 4 ° С.Кроме того, небольшое увеличение концентрации NaCl до 200 мМ показало положительный эффект на стабильность AsFur (рис. 2) по сравнению с MgCl 2 и KCl, где можно было увидеть лишь незначительные улучшения. Хотя стабильность при хранении AsFur была улучшена за счет вышеупомянутых изменений pH и концентраций NaCl, вариации партий все еще были частой проблемой при следующей характеристике.

Рис. 2

Влияние соли на термостабильность. Стандартные буферные условия: Трис-HCl, pH 7.5. (Цветной рисунок онлайн)

Присутствие двухвалентных металлов изменяет связывание ДНК с помощью AsFur

В классической схеме регуляции железо является основным функциональным металлом, который димеризует и активирует Fur in vivo . Способность меха эффективно активироваться широким спектром других ионов двухвалентных металлов in vitro вызвала дискуссии об истинном физиологическом металле, ответственном за активацию меха, хотя оценка сродства меха к металлу с помощью экспериментов по титрованию металлов предполагает, что только Fe 2+ демонстрируют достаточное сродство для активации меха в соответствующих диапазонах концентраций in vivo (Mills and Marletta 2005).Однако повышенные внутриклеточные концентрации других металлов могут иметь последствия для нормальной регуляции железа, а Fur, связанный с разными металлами, потенциально может действовать на разные ДНК-мишени (Hantke 1987).

Для измерения влияния ряда металлов на связывание AsFur-ДНК использовали анализ in vitro с использованием защиты сайта рестрикции в промоторе аэробактина (D’Autreaux et al. 2002). Функциональное связывание с помощью Fur обеспечивается отсутствием четвертой полосы длиной 251 п.о. на геле и увеличением размера верхней полосы до 1781 п.о.Анализ показал, что AsFur связывает промотор аэробактина металл-зависимым образом с присутствующим Mn 2+ (фиг. 3a). Кроме того, результаты на фиг. 3b показывают, что AsFur также способен связывать бокс Fur в присутствии катионов двухвалентных металлов Mn 2+ , Zn 2+ , Cu 2+ и Co 2+ . Fe 2+ считается наиболее физиологически значимым ионом металла для активации меха, однако он был исключен из этой панели, поскольку его быстрое окисление не позволяет использовать его в стандартных условиях анализа.Хотя плазмидная защита кажется более слабой для Mn 2+ по сравнению с Zn 2+ , Cu 2+ и, в частности, Co 2+ , Mn 2+ по-прежнему был предпочтительным выбором для последующих исследований взаимодействия AsFur-ДНК. , поскольку в структурных исследованиях было показано, что Mn 2+ и Fe 2+ сохраняют координацию металлов и аналогичное химическое поведение (Perard et al. 2018). Поведение AsFur в присутствии Cd 2+ не может быть интерпретировано, поскольку картина миграции напоминает таковую для необработанной плазмиды, что позволяет предположить, что HinfI ингибируется в присутствии Cd 2+ .

Рис. 3

Анализ плазмидной защиты, подтверждающий связывание ДНК AsFur в присутствии двух эквивалентов марганца ( a ) и идентификацию дополнительных металлов, способных активировать AsFur ( b ). Плазмида pDT10 расщеплялась HinfI в отсутствие или в присутствии активного меха, и расщепленный характер миграции анализировали с помощью электрофореза в 1% геле. Активный AsFur связывается со встроенным Fur-боксом в рестрикционном фрагменте длиной 1781 п.о. и защищает его от расщепления на фрагменты длиной 1530 п.о. и 251 п.н. a Lane 1: лестница 1 kb; Дорожка 2: плазмида pDT10; Дорожка 3: pDT10 + HinfI; Дорожка 4: pDT10 + апо AsFur + HinfI; Дорожка 5: pDT10 + AsFur + EDTA + HinfI; Дорожка 6: pDT10 + AsFur + Mn 2+ + HinfI; Дорожка 7: pDT10 + EcFur + Mn 2+ + HinfI. b Дорожка 1: плазмида pDT10 + апо AsFur + HinfI; Дорожка 2: pDT10 + As-Fur + Mn 2+ + HinfI; Дорожка 3: pDT10 + AsFur + Zn 2+ + HinfI; Дорожка 4: pDT10 + AsFur + Cu 2+ + HinfI; Дорожка 5: pDT10 + AsFur + Co 2+ + HinfI; Дорожка 6: pDT10 + AsFur + Cd 2+ + HinfI

Олигонуклеотиды разной длины и последовательности влияют на связывание Fur-ДНК

Консенсусная последовательность Vibrio с инвертированным повтором 19 пар оснований, 5′-AATGATAATAATTATCATT-3 ‘, а также E.coli Меховой бокс, 5′-GATAATGATAATCATTATC-3 ‘, сформировал матрицы для анализов EMSA ряда олигонуклеотидов (см. таблицу 1 для олигонуклеотидного состава). Отдельные основания и / или массивы оснований мутировали, чтобы исследовать возможные важные сайты связывания или важные расположения гексамеров. Были исследованы и оценены силы связывания.

Таблица 1 Олигонуклеотиды, отобранные и протестированные на взаимодействие с AsFur с помощью EMSA

Олигонуклеотиды были сгруппированы по консервации и длине.Сначала были проведены эксперименты EMSA для проверки взаимодействия AsFur с консенсусными последовательностями от обоих видов Vibrio и E. coli с использованием наименее консервативной последовательности Vibrio (Pedersen et al. 2010) в качестве отрицательного контроля (рис. 4). . Сильное взаимодействие наблюдалось с консенсусной последовательностью Vibrio (рис. 4a), а умеренное связывание также наблюдалось с консенсусной последовательностью E. coli (рис. 4b), при этом практически не обнаружено взаимодействия с наименее консервативной последовательностью Vibrio (анти- консенсус) даже при максимальной концентрации AsFur (рис.4в).

Рис. 4

Положительные и отрицательные контроли EMSA. — консенсусная последовательность Vibrio. b Консенсусная последовательность E. coli . c Антиконсенсусная последовательность Vibrio. 5 мкМ ДНК инкубировали с возрастающими концентрациями AsFur (0, 10, 20, 40 и 80 мкМ) для дорожек 1–5 соответственно. Эксперименты проводили в присутствии Mn 2+

. Последующие эксперименты EMSA проводились с олигонуклеотидами различного содержания по сравнению с двумя различными консенсусными последовательностями, чтобы исследовать влияние конкретных изменений оснований на силу взаимодействия с AsFur.Основными мишенями для экспериментального дизайна были взаимодействия AsFur-ДНК, предсказанные предыдущими МД-моделированиями и расчетами свободной энергии связывания (Pedersen et al. 2010). Для дальнейшего изучения существующих моделей взаимодействия Fur и ДНК были исследованы олигонуклеотиды различной длины (как короче, так и длиннее, чем Fur-бокс 19 п.н.), а также вариации в концах олигонуклеотидов, которые были либо тупыми, либо включали выступающий конец из 1 нуклеотида, способный образования «липкого» конца с соседними субстратами ДНК (таблица 1).Как и ожидалось, олигонуклеотиды показали разную силу взаимодействия с AsFur (фиг. 5). Для большинства экспериментов EMSA связывание AsFur заставляло субстрат удерживаться в лунках геля, что, скорее всего, отражает тенденцию AsFur к агрегации, возможно, вызванную начальным образованием комплекса ДНК.

Фиг. 5

эксперименты EMSA на вариантах консенсусных олигонуклеотидов Vibrio и E. coli , изменяющих отдельные положения и / или длину. Для каждого эксперимента 5 мкМ ДНК инкубировали с возрастающими концентрациями AsFur (0, 10, 20, 40 и 80 мкМ) для дорожек 1–5 соответственно.Позиции, отмеченные красным или темно-зеленым, обозначают модификации по отношению к консенсусным последовательностям Vibrio и E. coli соответственно. Эксперименты проводились в присутствии Mn 2+ . (Цветной рисунок онлайн)

Замена T12G / T13G значительно снижает взаимодействие AsFur с ДНК (рис. 5e) по сравнению с консенсусной последовательностью Vibrio (рис. 4a), предполагая, что это ключевые позиции для взаимодействия. Соответствующие положения нуклеотидов в клетке E.coli Fur box — это T15 и T16, которые, как ранее было показано, взаимодействуют с E. coli Fur в экспериментах по сшиванию (Tiss et al. 2005). Более того, моделирование молекулярной динамики с помощью AsFur показало, что T13 играет важную роль во взаимодействии с белками (Pedersen et al. 2010). Таким образом, мы представляем первые эксперименты EMSA, исследующие эти положения непосредственно в сравнении с консенсусной последовательностью Vibrio.

При сравнении замены A14G / C16A (рис. 5f) с консенсусной последовательностью Vibrio (рис.4а) наблюдается значительно меньшая способность к взаимодействию с AsFur. Эти положения нуклеотидов, как было ранее показано, вносят благоприятный вклад в связывание AsFur ДНК посредством моделирования свободной энергии связывания (Pedersen et al. 2010), а результаты EMSA дополнительно указывают на их участие в последовательностях-специфичных взаимодействиях. Интересно отметить, что замена A17G / C19G (фиг. 5j) в консенсусной последовательности E. coli (фиг. 4b) также имеет пагубный эффект, хотя и несколько менее выраженный, чем для консенсусной последовательности Vibrio.Интересно, что результаты подчеркивают важность обеих цепей ДНК во взаимодействии с Fur, поскольку эти положения нуклеотидов образуют часть первого гексамерного повтора G A T AAT на комплементарной цепи как консенсусной последовательности Vibrio, так и E. coli. Ящик для меха (изменен на T A C AAT и C A C AAT соответственно).

Индивидуальные замены A8C и T9G (рис. 5b, c) также приводят к гораздо более слабым взаимодействиям по сравнению с консенсусной последовательностью Vibrio (рис.4а). Ранее было показано, что богатые AT области важны для взаимодействий Fur-ДНК (Hantke 1981, 2001; Prince et al. 1991; Vasil and Ochsner 1999). В частности, последнее основание T единицы GATAA T (T 6 ) в модели гексамерного повтора, описанной на дополнительном рисунке S2b и c, соответствующее замещенному T9 в консенсусной последовательности Vibrio, было выделено из-за его роли. в распознавании ДНК с помощью отпечатков пальцев и тестов на отсутствие Т с помощью E. coli Fur (Escolar et al.1998). Соответствующий T на комплементарной цепи (T 5 ) показал сравнимый эффект во взаимодействиях. Однако комбинированные замены A8C / T9G (фиг. 5d) не проявляют аддитивного эффекта и имеют немного более сильное взаимодействие, чем отдельные замены. Интересно, что двойное удаление AT-нуклеотидов в ядре последовательности распознавания Vibrio, по-видимому, не приводит к дальнейшему снижению силы связывания.

Как и ожидалось, аналогично наименее консервативной последовательности Vibrio (рис.4c), который почти не обнаруживал признаков взаимодействия ДНК с AsFur, комбинированное изменение всех нуклеотидов, рассмотренных до сих пор (A8C / T9G / T12G / T13G / A14G / C16A; рис. 5g), приводило к значительно ослабленному взаимодействию с AsFur, хотя для В этом геле EMSA можно увидеть, что некоторые следовые количества AsFur перемещаются в лунки геля повсюду.

Для замен A1G / A2C / T3A (фиг. 5a) по сравнению с консенсусной последовательностью Vibrio (фиг. 4a) может наблюдаться существенно сниженная сила взаимодействия. Этот результат интересен с учетом различий в 5′-областях Vibrio и E.coli , где консенсусная последовательность Vibrio имеет трехнуклеотидную «вставку» (ААТ) по сравнению с классическим E. coli Fur box.

Важность минимальной длины консенсусной последовательности Vibrio во взаимодействиях AsFur была продемонстрирована в экспериментах EMSA на укороченных олигонуклеотидах по сравнению с консенсусной последовательностью Vibrio (рис. 5h, i), где и вариант с 16-нуклеотидным липким концом, и 15-нуклеотидные олигонуклеотиды с тупыми концами показали значительно сниженную силу связывания по сравнению с консенсусной последовательностью Vibrio.Это хорошо согласуется с предыдущими исследованиями EMSA на E. coli Fur, показывающими, что только слабое взаимодействие образуется, когда олигонуклеотиды значительно короче трех гексамерных повторов последовательности GATAAT (Lavrrar and McIntosh 2003).

Когда в некоторой степени аналогичные эксперименты были выполнены с гексамерными повторами GATAAT из E. coli , либо с 19-нуклеотидным вариантом с липким концом (рис. 5k), либо с 24-мерным четырехкратным повторением последовательности GATAAT (рис. . 5l) наблюдалась пониженная сила взаимодействия для обоих по сравнению с E.coli Меховой ящик (рис. 4б). Как указано выше, эти тенденции хорошо согласуются с экспериментами EMSA на EcFur с E. coli Fur box, а также с рядом повторов GATAAT, где сила взаимодействия была оценена как Fur box> 4 × GATAAT> 3 × GATAAT (Lavrrar и Макинтош 2003). Добавление липких концов к тройному повтору GATAAT в нашем исследовании, по-видимому, немного улучшает связывание.

Анализ AsFur по сравнению с функциональными и структурными гомологами

Для анализа структурных взаимодействий, вносящих вклад в специфичность связывания AsFur и вариаций канонических последовательностей Fur-box, последовательность AsFur сравнивали со структурно-детерминированными гомологами.Был идентифицирован ряд структурно охарактеризованных гомологов AsFur с идентичностью последовательностей в диапазоне от 86 до 30% (таблица 2 и фиг. 6). Выравнивание последовательностей между этими гомологами и AsFur выделяет несколько участков консервативных последовательностей как в ДНК-связывающем домене, так и в домене димеризации (DBD и DD, соответственно). Хотя обнаружено, что большинство охарактеризованных белков Fur являются димерами в растворе, некоторые также существуют в форме стабильных тетрамеров, например, Fur из Francisella tularensis и Pseudomonas aeruginosa (Nader et al.2019; Perard et al. 2018). В то время как консервативные позиции в DD в основном объясняются координацией металлов, консервативные участки в DBD участвуют во взаимодействиях с Fur box (Fig. 6).

Таблица 2 Сравнение AsFur с известными структурными гомологами Fur Рис. 6

Выравнивание последовательностей AsFur на основе структуры с известными структурными гомологами Fur. Сокращения приведены в таблице 2. EcFur не был включен, поскольку структура представляет только DBD. Идентификаторы PDB указываются между вертикальными линиями.Элементы вторичной структуры показаны над выравниванием спиралями и стрелками, обозначающими α-спирали и β-тяжи, соответственно. Идентичные остатки показаны белым на красном фоне, а консервативные остатки показаны красным. Остатки, относящиеся к координации металла с регуляторным сайтом S2 и структурным сайтом S3, обозначены треугольниками (окрашены в синий и красный цвета для S2 и S3, соответственно), тогда как остатки, образующие основные контакты, обозначены черной звездочкой. (Цветной рисунок онлайн)

На основании идентичности последовательностей между V.cholerae Fur (VcFur) и AsFur на 86%, кристаллическая структура VcFur (Sheikh and Taylor 2009) будет предпочтительным выбором для моделирования гомологии. Однако эта кристаллическая структура представляет собой Fur в несвязанном состоянии, и структурные выравнивания между несвязанным и связанным с ДНК состояниями структур MgFur выявили существенные движения в области DBD при связывании ДНК с VcFur и ДНК-комплексами MgFur, имеющими среднеквадратичные отклонения. 2,6–3,0 Å. Таким образом, для моделирования гомологии опубликованные структуры MgFur (Deng et al.2015) были выбраны в качестве шаблонов, несмотря на относительно низкое сходство последовательностей с AsFur. Выравнивание последовательностей между AsFur и MgFur выявило 37% идентичности для 135 остатков, которые могут быть выровнены по структуре, и позволило надежно моделировать весь белок, включая N-концевой ДНК-связывающий домен (DBD), который очень гибок в несвязанной форме. MgFur (Deng et al. 2015; Sarvan et al. 2018). Для сравнения различных возможных способов связывания AsFur были построены две модели: первая основана на димере MgFur, связанном с оператором feoAB1 в виде инвертированного повтора 9-1-9 (PDB4rb3; дополнительный рисунок S2a), а вторая основана на два димера MgFur, связанные с E.coli Меховой бокс в виде инвертированного повтора 7-1-7, смещенного на 6 нуклеотидов (PDB4rb1; дополнительный рисунок S2e). Сравнение этих моделей показывает сохранение аминокислот во взаимодействующих областях двух белков (рис. 7).

Рис. 7

Гомологические модели AsFur в двух режимах взаимодействия Fur-ДНК, наблюдаемых для MgFur и сообщенных Deng et al. (2015). a A димер AsFur, взаимодействующий с оператором feoAB1 . b Два димера AsFur, взаимодействующие с E.coli Коробка меховая. Каждый мономер AsFur окрашен индивидуально (мономер A, темно-зеленый; мономер B, бирюзовый; мономер C, фиолетовый; мономер D, красный), а цепи ДНК окрашены в темно-желтый и синий цвета для первичных и дополнительных цепей соответственно. Нуклеотиды, окрашенные в красный цвет, указывают на контакты оснований с AsFur. Смоделированные ионы Mn 2+ показаны серыми сферами. (Цветной рисунок онлайн)

Анализ структурных детерминант взаимодействия AsFur-ДНК

Модели гомологии, созданные на основе MgFur, были проанализированы для структурного обоснования вариаций силы взаимодействия из EMSA.

Это убедительно указывает на то, что AsFur Tyr56 формирует специфичные для оснований взаимодействия с большими бороздками посредством гидрофобных взаимодействий с метильными группами как T12, так и T13 (рис. 8b), объясняя наблюдаемое снижение аффинности связывания при замене T12G / T13G. Интересно, что это взаимодействие сохраняется в обеих структурных моделях, т.е. как в форме инвертированного повтора 9-1-9, так и в форме инвертированного повтора 7-1-7, смещенного на 6 нуклеотидов, что подчеркивает роль Tyr56 во взаимодействиях. с ДНК, содержащей меховую коробку.

Рис. 8

Предсказанные взаимодействия AsFur и нуклеотидных оснований из модели гомологии. Взаимодействия нуклеотидных оснований, наблюдаемые в модели гомологии AsFur, основанной на кристаллической структуре двух димеров MgFur в комплексе с E. coli Fur box (PDB4rb1). Нумерация нуклеотидов соответствует схеме нумерации, используемой для консенсусной последовательности E. coli в таблице 1. a Lys14 в мономере A взаимодействует в малой бороздке с T18 на первичной цепи и T3 ‘на комплементарной цепи. b Tyr56 в мономере B образует гидрофобные взаимодействия в большой бороздке с T15 ‘и T16’ на комплементарной цепи (идентичные взаимодействия образуются между Tyr56 в мономере D, созданном посредством операции кристаллографической симметрии, и T15 / T16 на первичной цепи ). c Arg57 в мономере D взаимодействует в большой бороздке с Т18 на первичной цепи и G1 ‘на комплементарной цепи. (Цветной рисунок онлайн)

Модель гомологии AsFur, взаимодействующей с E.coli Fur box (рис. 7b) также подчеркивает важность обеих цепей ДНК в этом взаимодействии, обеспечивая обоснование влияния замены A17G / C19G (рис. 5j) на контакты нуклеотидных оснований, образованные на 5′-конце дополнительной нити. Детальный вид взаимодействий, показанный на рис. 8a, c, показывает, что положения нуклеотидов в первом гексамерном повторе комплементарной цепи (G1 ‘и T3’) образуют взаимодействия нуклеотидных оснований малой и большой бороздок с консервативными остатками Lys14. и Arg57 соответственно.Arg57, по-видимому, формирует бидентатные специфичные для оснований взаимодействия с большой бороздкой, тогда как взаимодействия с малыми бороздками, формируемые Lys14, неспецифичны по основанию. Соответствующий остаток Lys в MgFur ранее, как было показано, взаимодействует с ДНК-мишенью посредством механизма считывания формы, где богатая AT область в каждом гексамерном повторе приводит к узкой малой бороздке с повышенным отрицательным электростатическим потенциалом (Deng et al. . Предыдущие исследования показали, что большинство ДНК-связывающих белков используют взаимодействие между режимами считывания основания и формы для распознавания своих сайтов связывания ДНК (Slattery et al.2014). Это, в свою очередь, допускает изменения в специфической последовательности нуклеотидов и для конкретного случая Fur, таким образом рационализируя степень вырожденности, обнаруживаемую среди последовательностей распознавания Fur.

Хотя обнаружено, что Lys14, Tyr56 и Arg57 также взаимодействуют с нуклеотидными основаниями в модели гомологии AsFur в комплексе с оператором feoAB1 (рис. 7a), эти взаимодействия не могут в той же степени оправдать структурную рационализацию вышеупомянутые эффекты из наших экспериментов EMSA, что снижает вероятность того, что AsFur взаимодействует с консенсусной последовательностью Vibrio и E.coli Меховой бокс в виде одного димера в виде перевернутого повтора 9-1-9.

Модель гомологии AsFur с E. coli Fur box не показывает прямых контактов в 5′-области консенсусной последовательности Vibrio (выше первого повтора GATAAT), что эквивалентно положению замены A1G. / A2C / T3A; однако вполне вероятно, что Lys14 из DBD мономера B может претерпевать конформационные изменения, чтобы участвовать во взаимодействиях с малыми бороздками. Фактически, предыдущие исследования показали, что коробку из меха следует расширить на 5′-конце, где Baichoo et al.(Baichoo and Helmann 2002) предложили дополнительное расширение T в B. subtilis Fur box, а Chen et al. (Chen et al. 2007), что блок E. coli Fur должен включать последовательность AAT, то есть идентичную консенсусной последовательности Vibrio.

Новый набор векторов для Fur-контролируемой экспрессии белка в условиях депривации железа у Escherichia coli | BMC Biotechnology

Реагенты, плазмиды, программное обеспечение и праймеры

Все реагенты были приобретены в Bioshop Canada, Inc.(Берлингтон, Онтарио), если не указано иное. Плазмиды, использованные в этом исследовании, приведены в таблице 1. Все карты плазмид были созданы с использованием SnapGene® Viewer (GSL Biotech; http://www.snapgene.com). Все последовательности праймеров, использованные в этом исследовании, находятся в Дополнительном файле 1: Таблица S1.

Таблица 1 Плазмиды, использованные в этом исследовании

Производство pFCF1 и pFCF2

Фрагмент ДНК длиной 489 пар оснований (gBlock1; дополнительный файл 2: рисунок S1) с фланкирующими сайтами NcoI и EcoRI, содержащими: ( i ) E.coli fepB / entC двунаправленная промоторная область, ( ii ) последовательность тега FLAG, ( iii ) последовательность сайта расщепления протеазой TEV и ( iv ) сайт множественного клонирования (MCS) из pUT18C (Euromedex ) был синтезирован как gBlock® (Integrated DNA Technologies, Сан-Диего, Калифорния). Этот фрагмент расщепляли NcoI и EcoRI (NEB) и клонировали в pACYC184, линеаризованную с помощью тех же рестрикционных ферментов. Полученный вектор был назван pFCF1. Для создания pFCF1- entA , pFCF1- entE и pFCF1- T25 , E.coli entA и entE ORF были амплифицированы с помощью ПЦР из конструкций на основе pCA24N, как сообщалось ранее [21]. Фрагмент B. pertussis T25 амплифицировали с помощью ПЦР из pKT25 (Euromedex). Продукты ПЦР субклонировали в сайты KpnI и EcoRI MCS pFCF1.

Фрагмент ДНК длиной 903 п.н. (gBlock2; Дополнительный файл 3: Рисунок S2), содержащий: ( i ) последовательность метки НА и ( ii ) ген устойчивости к канамицину ( KanR ) из pKT25 (Euromedex). синтезирован как gBlock® (Integrated DNA Technologies, Сан-Диего, Калифорния).Концы этого фрагмента содержали ~ 40-нуклеотидные области, которые перекрывались с соответствующими последовательностями выше и ниже сайтов NcoI и ScaI, соответственно, в pFCF1. Синтезированный фрагмент вставляли в pFCF1, расщепленный NcoI и ScaI, используя смесь Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs) в соответствии с протоколом производителя. Полученный вектор был назван pFCF2. ORF E. coli entA субклонировали между сайтами KpnI и EcoRI расщепленного pFCF2 с образованием pFCF2- entA .Конструкции pFCF1 и pFCF2 были проверены секвенированием ДНК (Университет Макгилла и Центр инноваций Génome Québec).

Производство pFBh2

Фрагмент ДНК длиной 522 п.н. (gBlock3; Дополнительный файл 4: Рисунок S3), содержащий: ( i ) область двунаправленного промотора E. coli fepB / entC , ( ii ) последовательность HA-метки, ( iii ) последовательность сайта расщепления протеазой TEV и ( iv ) сайт множественного клонирования (MCS) из pUT18C (Euromedex) были синтезированы как gBlock® (Integrated DNA Technologies, Сан-Диего, Калифорния) .Концы этого фрагмента содержали 25-нуклеотидные области, которые перекрывались с соответствующими последовательностями выше и ниже сайтов EcoRI и SalI, соответственно, в pBR322. Фрагмент вставляли в pBR322, расщепленную EcoRI и SalI, с использованием смеси Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs) в соответствии с протоколом производителя. Полученный вектор был назван pFBh2. ORF E. coli entB субклонировали в сайты KpnI и EcoRI MCS pFBh2. Конструкция pFBh2 была проверена секвенированием ДНК (Университет Макгилла и Центр инноваций Génome Québec).

CAS-анализы

Все плазмидные конструкции и пустые контрольные векторы трансформировали в соответствующие E.coli BW25113 (F , Δ (araD-araB) 567, ΔlacZ4787 (:: rrnB-3), λ ). , rph-1, Δ (rhaD-rhaB) 568, hsdR514 ), нокаутные штаммы [22], которые были модифицированы для удаления гена устойчивости к канамицину, как сообщалось ранее [21]. Штаммы, трансформированные pFCF1, pFCF1- entA и pFCF1- entE , высевали на агар LB, содержащий 12.5 мкг / мл тетрациклина. Штаммы, трансформированные pFCF2, pFCF2- entA , высевали на агар LB, содержащий 12,5 мкг / мл тетрациклина и 50 мкг / мл канамицина. Штаммы, трансформированные pFBh2 или pFBh2- entB , высевали на агар LB, содержащий 100 мкг / мл ампициллина. Все планшеты инкубировали в течение ночи при 37 ° C. Ночные культуры (бульон LB с соответствующим антибиотиком) из колоний разводили 1: 1000 в 1 × модифицированной среде M9 [21] и 12,5 мкг / мл тетрациклина с 50 мкг / мл канамицина или 100 мкг / мл ампициллина или без них.Минимальные средние культуры выращивали при 37 ° C в течение ночи. Чашки с CAS-агаром с добавлением соответствующих антибиотиков готовили в соответствии с Payne et al. [23]. На планшеты CAS наносили 1 мкл ночных культур и инкубировали при 37 ° C в течение приблизительно 16 часов. Наличие оранжевых ореолов свидетельствовало о биосинтезе энтеробактина [24]. Каждый анализ CAS проводили в трех экземплярах.

Исследования роста

Отдельные колонии трансформантов, использованные для анализов CAS, использовали для инокуляции бульона LB, дополненного соответствующими антибиотиками.Ночные культуры разбавляли 1: 100 в LB плюс антибиотики, а затем выращивали при 30 ° C до тех пор, пока они не достигли значения A 600 , равного 1,00. Культуры центрифугировали в течение 1 мин при 21000 × g и клеточные осадки ресуспендировали в 1 × модифицированной среде M9, так что все культуры разбавлялись до эквивалентной плотности клеток (A 600 = 1,00). Затем готовили культуры для измерений роста путем разбавления 1: 1000 в 1 × модифицированной среде M9 плюс 50 мкМ 2,2′-дипиридил, содержащего соответствующий антибиотик. Разбавленные культуры инкубировали при 30 ° C в течение 16 ч при перемешивании.Плотность клеток измеряли как значения A 600 . Эксперименты по выращиванию проводили в трех повторностях.

Были проведены дополнительные исследования роста трансформантов pFCF2- entA , чтобы продемонстрировать, что ген устойчивости к канамицину в этой конструкции находится под контролем Fur. Выбранные колонии из E. coli BW25113 entA Штамм , трансформированный pFCF2- entA , использовали для инокуляции 3 мл бульона LB, содержащего 12.5 мкг / мл тетрациклина и 50 мкг / мл канамицина. Ночные культуры, инкубированные при 30 ° C, разбавляли 1: 100 в бульоне LB, содержащем 12,5 мкг / мл тетрациклина и 50 мкг / мл канамицина, и затем выращивали при 30 ° C до достижения A 600 , равного 1,0. Культуры центрифугировали в течение 1 мин при 21000 × g и клеточные осадки ресуспендировали в 1 × модифицированной среде M9, так что все они были разбавлены до эквивалентной плотности клеток (A 600 = 1,00). Затем были приготовлены культуры для измерений роста путем разбавления 1: 1000 одним из следующих: ( i ) 1 × модифицированная среда M9 плюс 50 мкМ 2,2′-дипиридил, содержащий 12.5 мкг / мл тетрациклина, ( ii ) 1 × модифицированная среда M9 плюс 50 мкМ 2,2′-дипиридил, содержащий 12,5 мкг / мл тетрациклина и 50 мкг / мл канамицина, ( iii ) бульон LB, содержащий 40 мкМ FeSO 4 , 12,5 мкг / мл тетрациклина, 0,2% глюкозы и ( iv ) LB бульон, содержащий 40 мкМ FeSO 4 , 12,5 мкг / мл тетрациклина и 50 мкг / мл канамицина, 0,2% глюкозы. Разбавленные культуры инкубировали при 30 ° C в течение 16 ч при перемешивании. Плотность клеток измеряли как значения A 600 .Эксперименты по выращиванию проводили в трех повторностях.

Вестерн-блоттинг

Экспрессионные конструкции трансформировали в компетентные клетки E. coli BW25113. Выбранные одиночные колонии трансформантов использовали для инокуляции бульона LB, дополненного соответствующими антибиотиками. Ночные культуры разбавляли 1: 100 в LB плюс антибиотики, а затем выращивали при 30 ° C до достижения A 600 , равного 1,0. Культуры центрифугировали в течение 1 мин при 21000 × g и осадок клеток ресуспендировали в 1 × модифицированной среде M9, а затем разбавляли до эквивалентной плотности клеток (A 600 = 1.00). Культуры готовили разбавлением 1: 1000 в обедненной железом среде (1 × модифицированная среда M9 плюс 100 мкМ 2,2′-дипиридил и соответствующие антибиотики) и / или богатой железом среде (бульон LB, содержащий 40 мкМ FeSO 4 , 0,2% глюкозы и соответствующие антибиотики) с последующей инкубацией при 30 ° C в течение 16 ч при перемешивании. Клетки (100 мг сырого веса) из ночных культур осаждали центрифугированием при 3000 × g при 4 ° C в течение 30 мин, а затем ресуспендировали в буфере для лизиса (50 мМ Трис (pH 8,0), 1% н-октил-BD-тиоглюкопиранозид, 3 мкг / мл ДНКазы I, 3 мкг / мл РНКазы A, 30 мкг / мл лизоцима, 1 мМ DTT, 1 × коктейль ингибиторов протеазы).Лизаты целых клеток инкубировали на нутовом смесителе в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем центрифугировали в течение 5 мин при 21000 × g. Супернатанты собирали для вестерн-блоттинга. Аликвоты лизатов очищенных клеток разделяли на 10% SDS-полиакриламидных гелях. После гель-электрофореза разделенные белки переносили на PVDF-мембрану с использованием электрофорезной переносной ячейки Mini-Trans Blot (Bio-Rad Laboratories). Мембрану блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре, используя 5% сухое обезжиренное молоко в PBST (137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4 , 1,8 мМ KH 2 PO 4 , 0,2% Твин 20). Блокированные мембраны инкубировали с одним из следующих первичных антител в течение 1 ч при комнатной температуре или при 4 ° C в течение ночи: ( i ) мышиное моноклональное антитело против FLAG (разведение 1: 1000; Thermo Fisher Scientific), ( ii ). ) мышиное моноклональное антитело против НА (разведение 1: 1000; Pierce), ( iii ) мышиное моноклональное антитело против GAPDH (1: 10 000; Thermo Fisher Scientific).Козьи антимышиные конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) (разведение 1: 10 000–1: 20 000; Santa Cruz Biotechnology) использовали в качестве вторичных антител. Активность HRP визуализировали с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal ™ West Pico (Thermo Fisher Scientific).

Идентификация активируемых железом и репрессированных Fur-зависимых генов с помощью транскриптомного анализа Neisseria meningitidis группы B

Реферат

Железо ограничено в организме человека-хозяина, и бактериальные патогены реагируют на это. окружающей среды, активируя гены, необходимые для бактериальной вирулентности.Регуляция транскрипции в ответ на железо у грамотрицательных бактерий в значительной степени опосредуется белком-регулятором захвата железа Fur, который в наличие железа связывается с определенной последовательностью в промоторных областях генов под его контролем и действует как репрессор. Здесь мы описываем микрочип ДНК, вычислительных и in vitro исследований для определения регулона меха в патоген человека Neisseria meningitidis группа В (штамм MC58). После добавление железа к обедненной железом бактериальной культуре, 153 гена были с повышенным регулированием и 80 с пониженным регулированием.Только 50% генов, регулируемых железом было обнаружено, что в их промоторе содержатся консенсусные последовательности, связывающие Fur. регионы. Было амплифицировано 42 промоторных участка, 32 из которых были показаны. для связывания меха с помощью гель-сдвигового анализа. Среди этих генов многие из которых никогда не ранее описывались как регулируемые по меху, 10 из них имели повышенную регуляцию на железе Кроме того, демонстрируя, что Fur может также действовать как активатор транскрипции. Выравнивание последовательностей Fur-связывающих областей показало, что N. meningitidis Меховая коробка включает в себя высококонсервативные (NATWAT) 3 мотив.Кластерный анализ оказался эффективным в прогнозировании Гены, регулируемые мехом, даже если компьютерное предсказание не смогло идентифицировать Последовательности, подобные Fur-box в их промоторных областях. Ген, созданный на микрочипах профилирование выражений представляется очень эффективным подходом к определению новых регулоны и регуляторные пути у патогенных бактерий.

Железное голодание используется многими патогенами как сигнал о том, что они находятся в среды хозяина, приводящей к выражению факторов вирулентности, которые транскрипционно регулируется железом через регулятор поглощения железа протеин Мех.Мех образует димер с двухвалентным железом и связывается с консенсусная последовательность (Fur-box), которая перекрывает промоторы регулируемых железом гены, что приводит к подавлению транскрипции. Гомологи меха были идентифицированы у многих грамотрицательных и -положительных бактерий, включая важные патогены человека (1–5). Недавние исследования показывают, что Fur функционирует как регулятор генов, участвующих в различные клеточные процессы, такие как реакция на кислотный шок, хемотаксис, метаболические пути, биолюминесценция, производство токсинов и факторы вирулентности (6–11).У некоторых организмов мех может также действовать как положительный регулятор при контроле генов. выражение (12–15), хотя взаимодействия между белком Fur и операторской областью гены, активируемые железом, подробно не изучены.

Патогенные neisseriae, по-видимому, также регулируют экспрессию нескольких гены в ответ на железо, включая специфические факторы вирулентности (16). Однако исследования Нарушена мехзависимая регуляция железа генов Neisseria из-за невозможности сконструировать нулевой мутант fur .Промах мутант Neisseria gonorrhoeae fur был изменен в железная регуляция широкого спектра генов, поддерживающих существование большого набор генов, которые могут находиться под контролем меха (17). Наши последние исследования в N. gonorrhoeae установили, что гонококковый белок Fur связывается с промоторными областями нескольких генов, участвующих в различных метаболических процессах. пути (18). Эти первоначальные отчеты привели нас к постулированию, что патогенные neisseriae обладают широким спектром генов, экспрессия которых находится под контролем транскрипционного регуляторный белок Fur.Для дальнейшего определения репертуара генов, регулируется железом и мехом у neisseriae, в настоящем исследовании мы использовали ДНК технология микрочипов для мониторинга кинетики экспрессии всего гена репертуар из Neisseria meningitidis MC58 (19, 20) в ответ на железо.

Экспериментальные процедуры

Условия роста. Выращено культур N. meningitidis MC58. в среде определенного химического состава с 12,5 мкМ десфераля (обедненного железом) в течение 3 часов.После этой адаптации к железному голоданию половина культуры пополнилась с 100 мкМ нитрата железа, и рост продолжался в течение 5-часового периода. Аликвоты из двух культур были удалены в разные моменты времени, и бактериальная РНК был подготовлен, как описано ниже.

Процедуры, гибридизация и анализ микрочипов. ДНК микрочип анализ был выполнен, как описано (19). Зонд гибридизации был составлен смесью по-разному меченых кДНК, полученных из бактериальные культуры, выращенные в условиях с высоким или низким содержанием железа.Для каждого изображения, значение сигнала каждого пятна определялось путем вычитания среднего значения интенсивность пикселей фонового значения и нормализация к медиане всех точечные сигналы. Пятна, дававшие отрицательное значение после фона вычитания, произвольно присвоили значение стандартного отклонения отрицательные контроли. Данные, полученные в результате прямой и обратной маркировки, были усредненные для каждого места. Коэффициенты экспрессии были получены в каждый момент времени с помощью прямое сравнение РНК, полученной из бактериальных культур, выращенных в наличие железа с РНК, полученной из бактериальных культур, выращенных в наличие десферала.Данные для каждой временной точки представляют собой среднее значение в минимум три независимых эксперимента. Точность и статистическая значимость соотношений экспрессии были определены с применением анализа, предоставленного программа КИБЕР-Т (http://visitor.ics.uci.edu/genex/cybert). Чтобы обработать наши данные с помощью CYBER-T, для каждого пятна мы рассчитали коэффициенты log 2 и парное значение выражения для оценки среднего уровня выражения в пределах наборы экспериментальных и контрольных данных. Гены, коэффициенты экспрессии которых изменились > 2 раза и имел значений P <0.01 считались активными или с пониженным регулированием. Гены со значением P > 0,01 не рассматривались как регулируется, независимо от уровня их дифференциальной экспрессии. Модель P значение, полученное расчетами CYBER-T, представляет собой вероятность специфический ген, который будет по-разному экспрессироваться в двух экспериментальных условия.

Кластерный анализ. Наборы данных, полученные с помощью анализа микрочипов в течение 5 часов роста были подвергнуты кластерному анализу с помощью ARRAYSCOUT программное обеспечение (LION bioscience, Гейдельберг).Иерархическая кластеризация использовалась для анализировать паттерны экспрессии генов с повышенной и пониженной регуляцией. В нецентроидный UPGMA (метод невзвешенных парных групп со средним арифметическим; исх. 21) алгоритм был применен к генерировать набор иерархических кластеров на профилях экспрессии 235 регулируемые гены.

ОТ-ПЦР. Тотальная РНК была выделена из N. meningitidis MC58 с помощью с использованием набора RNeasy (Qiagen, Валенсия, Калифорния), и ОТ-ПЦР выполнялась с использованием набор SuperScript RT-PCR (Invitrogen), рекомендованный производителем.Образцы объемом пять микролитров были собраны с пяти интервалами цикла ПЦР и электрофорез в 1% агарозном геле. Плотность полос измерялась с помощью программного обеспечения для количественного анализа Bio-Rad QUANTITY ONE 4.0.

Исследования связывания меха. Способность меха связываться с геном проксимальные области промотора определяли по электрофоретической подвижности-сдвигу анализ (EMSA) на ПЦР-амплифицированных фрагментах, как описано (18).

Результаты

Глобальный анализ N.meningitidis Экспрессия гена во время роста в условиях Состояния, насыщенные железом и обедненные железом. Чтобы изучить одновременное выражение всего репертуара генов N. meningitidis MC58 в ответ на железа, РНК-профили бактерий, выращенных в присутствии и в отсутствие железа, были сравнивали в течение 5-часового периода с использованием микрочипов полного генома. Рост Н. meningitidis MC58 в присутствии железа изменяет экспрессию 235 гены (11% генома N. meningitidis MC58) более чем в 2 раза в трех независимые эксперименты (таблица 1 и рис.4, которые опубликованы как вспомогательные информация на веб-сайте PNAS, www.pnas.org). Высокий процент генов был активирован (153 гена), тогда как 80 были активированы. с пониженной регулировкой и 2 были либо с повышением, либо с понижением в зависимости от времени роста. Функциональная классификация генов с измененной экспрессией профиль показал, что наиболее распространенной группой генов было семейство гипотетических генов (84 гена), из которых 49 были активированы, а 34 — с пониженной регуляцией (рис. 4). Три других хорошо представленных семьи, которые были в первую очередь активируются при добавлении железа, включая гены, участвующие в выработке энергии метаболизм, синтез белка и сборка клеточной оболочки.В добавок к гены, принадлежащие к гипотетическому семейству, наиболее многочисленным семействам подавленные гены — это гены, кодирующие белки, участвующие в клеточных и транспортные процессы, включая гены, которые непосредственно отвечают за железо захват и транспортировка.

Вычислительный анализ последовательности связывания меха в Промоторные / операторные области генов, регулируемых железом. В попытке предсказать, какой из железорегулируемых генов N. meningitidis контроль транскрипционного регуляторного белка Fur, мы сначала сгруппировали все железо-регулируемые Н.meningitidis в предполагаемые транскрипционные единицы (определяемые как кластер смежных генов, имеющих межгенные области длиной менее 50 п.н.). Исходя из этого анализа, 235 Гены, регулируемые железом, были объединены в 203 предполагаемых транскрипционных единицы. Мы затем выполнили вычислительный анализ проксимальных областей промотора все регулируемые железом транскрипционные единицы в поисках потенциального связывания с Fur последовательности. Метод поиска гомологии был выполнен с использованием FINDPATTERN программа WISCONSIN PACKAGE (Accelrys, San Diego) по умолчанию параметры, допускающие максимальное несовпадение 37%.Вышестоящие области длиной 400 п.н. каждой транскрипционной единицы сканировали на наличие ( и ) Escherichia coli Консенсусная последовательность Fur (не менее 12 из 19 п.н. идентичность) (22), ( ii ) консенсусная последовательность Neisseria Fur (идентичность не менее 13 п.н. из 21 п.н.) (23), ( iii ) (NATWAT) 3 последовательность (12 совпадений из 18 п.н.), недавно предложенная в качестве E. coli Меховая коробка (6, 24) и ( iv ) Связывающие с мехом последовательности меха Neisseria gonorrhoeae и генов fbpA (не менее 12 из 19 и 13 из 33 пар пар соответственно) недавно нанесен на карту в результате экспериментов по отпечатку ДНК (23, 25).Этот анализ показал что ≈50% всех железо-регулируемых генов N. meningitidis (включая гены с повышенной и пониженной регуляцией) могут находиться под прямым контролем Fur (Таблица 2, которая опубликована в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS). В частности, 104 региона имели гомологию хотя бы с одним из пяти Последовательности связывания меха, используемые для компьютерного анализа. Из этих регионов 70 было обнаружено, что они несут последовательность ДНК с достаточной гомологией Neisseria или E.coli Fur консенсусная связывающая последовательность в пределах Вышестоящие последовательности длиной 250 п.н. Также было обнаружено, что подмножество этих генов содержит последовательности с гомологией консенсусной связывающей последовательности Fur, состоящей из три повтора последовательности NATWAT. В некоторых случаях отдельные меховые коробки были обнаружены более одного раза на одном и том же межгенном участке. Обычно Последовательности, связывающиеся с мехом, располагались в пределах 150 п.н. от начала транскрипции. сайт генов с пониженной регуляцией, тогда как Fur-связывающие последовательности гены, активируемые железом, имели более разбросанное распределение (данные не показаны).

Биохимическое подтверждение активности связывания с мехом. Для поддержки надежность как данных микрочипа, так и компьютерных предсказаний Fur-box, мы отобраны четыре гена, репрессированных железом ( recN , NMB0034, NMB0744 и NMB0866) и четыре гена с усиленной регуляцией ( pan1, kat, nspA и NMB1436) несущие высококонсервированные меховые коробки и подвергали их двум типам анализ. Во-первых, мы измерили их уровни транскрипции при избытке железа и -удаленные условия с помощью ОТ-ПЦР, начиная с тех же образцов РНК, которые использовались в эксперименты с микрочипами.Во-вторых, вышележащие промоторные области этих генов были ПЦР-амплифицированы и использованы в гелевом сдвиговом анализе с E. coli и / или Neisseria Мех. Эти два анализа подтвердили микрочип и данные компьютерного прогнозирования, соответственно (Таблица 2, Рисунок 1).

Рис.1.

RT-PCR проверка соотношений экспрессии микрочипов и EMSA промотора области генов с повышенной и пониженной регуляцией. ( A Левый и Центральный ) ОТ-ПЦР и относительное количество мРНК rmp , использованных как отрицательные контроль, полученный из 2-часовой культуры, выращенной в условиях богатого железом (Fe) и -обеденные (Df) условия.Циклы ПЦР, в которых анализировали транскрипты: указано над каждой полосой. M, молекулярная масса. ( A Правый ) Меховой переплет к области промотора rmp с помощью анализа EMSA. Дорожки: 1, без белка; 2, E. coli Мех; 3, Neisseria Мех. ( B ) Анализ ОТ-ПЦР репрезентативных генов с пониженной и повышенной регуляцией, полученных из бактериальных культуры, взятые через 2, 3 и 5 часов роста в богатых железом (Fe) и обедненных железом (Df) условия. ( C ) EMSA-анализ проксимальных областей промотора генов, регулируемых железом, представленных в B .Дорожки: 1, без белка; 2, E. coli Мех; 3, Neisseria Мех.

Кроме того, случайным образом были выбраны 34 регулируемых единицы транскрипции и их расположенные выше промоторные области были амплифицированы и подвергнуты гелевому сдвигу. анализ. В выборку вошли 20 единиц транскрипции с узнаваемыми Последовательности меха-бокса и 14 генов, для которых как компьютерный анализ, так и руководство проверка не смогла идентифицировать достаточно консервативную консенсусную последовательность Fur в их верховьях (табл. 2).Всего 32 из 42 промотор-проксимальных области, подвергнутые гель-сдвиговому анализу, относились к классу подавленные транскрипционные единицы; остальные 10 регионов были из активируемые гены (таблица 2). И E. coli , и Neisseria . Было обнаружено, что белки меха связываются с промоторными / операторными областями 24 из 32 с пониженной регуляцией транскрипционных единиц и 8 из 10 транскрипционных единиц с повышенной регуляцией единицы измерения.

Наличие экспериментальных данных по активности связывания меха на 42 промотор-проксимальные области дали возможность определить надежность in silico предсказание Neisseria Fur-box.Мы нашли что 27 из 28 промоторных областей, несущих узнаваемые Fur-боксы, способны к связывание E. coli и Neisseria Fur (таблица 2). в случай 14 амплифицированных фрагментов без распознаваемых последовательностей Fur-box, 9 не были задержаны Фуром в экспериментах со сдвигом геля; однако оставшиеся 5 фрагментов показали сродство как к E. coli , так и к Neisseria Белки меха (таблица 2).

Анализ консенсусной последовательности связывания меха N. meningitidis. Гель-сдвиговой анализ, описанный выше, позволил идентифицировать 32 фрагмента ДНК способен взаимодействовать как с Neisseria , так и с E. coli Fur, 27 из которых имели предсказуемую меховую коробку. Поэтому мы предположили, что последовательность выравнивание этих фрагментов вместе с выравниванием Промотор-проксимальные области ранее охарактеризованного Neisseria Зависимые от меха транскрипционные единицы (17, 18, 26), должен определять достаточно надежный Н.meningitidis Консенсусная последовательность меха. К чтобы облегчить это выравнивание, мы сначала сканировали каждый фрагмент на наличие последовательность Fur E. coli , а затем запустила гомологию поиск по ограниченному участку каждого из этих фрагментов ≈70 нт с E. coli -подобная Fur-связывающая последовательность. В некоторых случаях более одного Меховая шкатулка была предсказана на том же фрагменте, в результате чего общее количество области, выровненные для определения консенсусной последовательности Fur-box.Анализ определил консервативную область из ≈40 нуклеотидов, сосредоточенную вокруг высокоэффективного консервативная последовательность, состоящая из 4-кратного повторения гексамера NATWAT недавно предложенный Escolar et al. (24) быть E. coli Fur-связывающая последовательность (рис. 2). Основываясь на нашем настоящем анализе, N. meningitidis Fur-box включает последовательности, гомологичные предлагаемым E. coli и N. gonorrhoeae Меховые ящики (таким образом полностью оправдывая способность E.coli Мех для связывания N. meningitidis , регулируемых железом промотор-проксимальные области), но простирается на более длинный участок нуклеотида в какие нуклеотиды AT особенно многочисленны.

Рис.2.

Множественное выравнивание последовательностей вышележащих областей EMSA-положительных генов. ( Верхний ) График, показывающий представление каждого нуклеотида полученная консенсусная последовательность выше частоты нуклеотидов генома MC58. ( Нижний ) Попарное согласование производного консенсуса с Предлагаемые ранее меховые шкатулки.Красным выделен наиболее консервативный регион. полученного консенсуса, совпадающего с ранее предложенным Fur-связывающим консенсусная последовательность (16–18).

Кластерный анализ генов, регулируемых железом Neisseria. доступность профилей экспрессии РНК в восьми различных временных точках цикл роста позволил нам провести кластерный анализ всех Neisseria гены, регулируемые железом. Когда неконтролируемый иерархический кластеризация, кластер из 39 генов с пониженной регуляцией может быть определена на восьмом уровне иерархии, которая была значительно обогащена экспериментально доказано, что гены связывают мех (Рисунок.3). Этот кластер включал 26 Fur-регулируемых генов, подвергнутых либо гелевому анализу в этом исследовании, или для анализа гелевого сдвига и / или следа в N. gonorrhoeae (17, 18, 26). Наш кластерный анализ указали, что несколько генов, демонстрирующих положительный сдвиг гелевого сдвига анализ, сгруппированный в кластеры с генами, которые были отрицательными в гель-сдвиге анализ, указывающий на то, что не все гены, как было установлено, связываются с белком Fur имел аналогичный профиль экспрессии РНК. Кроме того, 9 из 11 активируемых генов промоторные области которых, как было показано, связывают Fur, также сгруппированы в общие кластер, характеризующийся постоянно активируемыми генами (Рисунок.3). Взяты вместе, кластерный анализ ясно показывает, что все гены демонстрируют постоянную Понижающее регулирование в условиях повышенного содержания железа регулируется Fur. Гены наличие разных профилей транскрипции не может быть исключено a priori от регулона меха и, вероятно, представляют гены с более сложным регуляторным механизм, в котором Fur не может быть единственным регуляторным белком.

Рис.3.

Неконтролируемая иерархическая кластеризация N. meningitidis гены, регулируемые железом.Гены сгруппированы по сходству их транскрипционный профиль в течение периода роста. Коэффициенты экспрессии генов: представлены столбиками; зеленый и красный указывают на пониженную и повышенную регуляцию генов, соответственно. Вертикальные линии обозначают кластеры, содержащие гены. проанализированы EMSA, названия которых указаны рядом, вместе с результаты EMSA-анализа и вычислительного поиска Fur-box. В темно-зеленые вертикальные полосы указывают на пониженную регуляцию кластеров генов, а светло-зеленые вертикальные полосы указывают на группу сильно пониженных, Мех-зависимые гены.Названия генов организованы как единая транскрипционная форма. единицы отображаются одним цветом.

Обсуждение

Обширные физиологические исследования патогенных neisseriae выявили относительно немного примеров регуляции экспрессии генов путем связывания ДНК белки. Среди них было предложено, чтобы регуляторный белок Fur функция контроля нескольких предполагаемых факторов вирулентности, необходимых для выживание в человеческом хозяине. Однако подробный анализ роли Регуляция гена Fur in Neisseria ранее не проводилась.В этом исследовании мы использовали технологию микрочипов вместе с вычислительной техникой. анализ и in vitro исследований связывания для идентификации мишеней Fur белок, регулирующий транскрипцию, у N. meningitidis . Наши исследования демонстрируют, что железо может регулировать широкий спектр N. meningitidis гены через Fur-зависимые и -независимые пути.

Наш анализ микроматрицы показывает, что в условиях обеднения железом несколько генов, связанных с вирулентностью, сверхэкспрессируются.К ним относятся NMB0393, NMB0977 и NMB1857, которые гомологичны E.coli, вовлеченным генам . в производстве токсинов и множественной лекарственной устойчивости (27), NMB0103, который кодирует предполагаемый белок устойчивости к бактериоцину и гены, кодирующие поверхностные белки потенциально участвует в клеточной адгезии: белок адгезионного комплекса NMB2095, белок NMB2016, связанный с пилином IV типа, липопротеин NMB1898, FrpC белок (NMB1415) и гены, родственные frpA / C , NMB0364, NMB0584, NMB1402, NMB1405, NMB1412 и NMB1414.Наблюдения, которые большинство эти гены группируются в одно и то же семейство кластеров, и проксимальный к промотору области нескольких из этих генов сильно связывают Fur в гелевом сдвиговом анализе. предполагают, что регуляция этих генов напрямую опосредуется Fur. ДНК механизмы рекомбинации и восстановления являются дополнительными важными процессами для Neisseria патогенез и может поддерживать бактериальную адаптацию к хост-среда. Сообщалось, что голодание по железу вызывает антигенные действия пилина. вариация за счет увеличения частоты рекомбинационных событий (28).В соответствии с этими исследования, наши результаты показывают, что ген recN находится под контролем меха и предполагают, что в N. meningitidis Fur может быть непосредственно участвует в процессах рекомбинации и репарации ДНК.

Интересным открытием в этом исследовании было наблюдение, что рост N. meningitidis в условиях повышенного содержания железа приводило к повышенная экспрессия широкого спектра генов, значительная часть которые несут потенциальные Fur-связывающие последовательности в проксимальном к промотору регионы.В частности, мы показали, что выражение secY и sodB , ранее продемонстрированные как компоненты гонококкового меха регулон (18), также увеличилось в условиях избытка железа у N. meningitidis , и что Мех был способен связывать промоторную область этих генов. Другой интересные гены, которые активируются во время роста с железом, были NSPA и ANI . Известно, что белок NspA вызывает защитный ответ антител против Н.meningitidis серогрупп A, B, и C (29, 30) и недавно был предложен в качестве вакцины-кандидата для профилактики менингококковой инфекции. В ani Ген , кодирующий редуктазу оксида нитрита, является одним из ключевых ферменты, участвующие в анаэробном дыхании нитратов / нитритов и азота ассимиляции, и было показано, что он является основным антигеном у пациентов с гонококковой инфекцией. болезнь (31). Рядом с aniA и транскрибируется в обратном направлении — это norB ген, который кодирует редуктазу оксида азота, второй фермент азота путь ассимиляции.Этот ген также постоянно активируется во время роста. с железом и, по-видимому, имеет в своем вышестоящая промоторная область. Наши результаты показывают, что aniA и norB может пройти как минимум два уровня положительного регулирования; один опосредовано Fur, а другое — положительным регулятором Fnr, геном который, как известно, активируется в строгих анаэробных условиях (32, 33). Точно настроенное регулирование из этих двух генов могут иметь важные биологические последствия.Хотя это согласованный механизм регуляции ожидает экспериментальной поддержки, возможная роль для fnr в N. meningitidis может быть предусмотрена вирулентность, посредством чего Fnr, совместно с Fur, регулирует ряд генов, которые становятся имеет значение для оптимального выживания и роста бактерий в организме хозяина.

Некоторые из генов, регулируемых железом, идентифицированных в этом исследовании, относятся к гипотетическое семейство генов, подчеркивая, что еще предстоит понять биология и биохимия регуляции железа в Neisseria .Особенно интересен трехгенный оперон (NMB 1436–38), который повышается при добавлении железа. Вычислительный анализ показывает, что один из эти гены кодируют белок, несущий кластер железо-сера, мотив часто встречается в ферментах, участвующих в детоксикации кислорода радикалы. Недавно мы сконструировали мутант N. meningitidis . несущие полную делецию этого оперона и обнаружили, что мутант очень чувствительны к перекиси водорода (R.G. and G.G., неопубликованные исследования).Таким образом, разумно предположить, что функция этого оперона состоит в том, чтобы улавливать высокотоксичные кислородные радикалы, продуцируемые в клетке реакция Фентона, катализируемая железом.

Принимая во внимание, что репрессивный механизм Меха был тщательно исследован (6) механизм положительного регуляция этим белком не была хорошо выяснена (13, 14). Недавнее исследование (15) предполагает, что часть Активирующие свойства меха могут быть определены на посттранскрипционном уровне. В г.coli , малая РНК (RyhB), которая негативно регулируется Fur было показано, что понижает регуляцию набора белков, запасающих железо, когда железо предельное (15). Хотя наши поиск генома N. meningitidis MC58 не выявил ryhB гомолог, нельзя исключить наличие такого механизма у Н. meningitidis . Мех также может использовать различные механизмы ДНК. привязки, которые зависят от оператора, что приводит к дифференциальному регулированию. Delany et al. (12) продемонстрировали, что в Helicobacter pylori белок Fur связывает к активированному железом промотору pfr и что Fe 2+ снижает эффективность связывания. Кроме того, эти исследователи сообщили, что структурные различия очевидны между активированным железом pfr промотор и промотор с репрессией железом.

Представленные здесь данные показывают, что железо также может регулировать ген выражение в независимой от меха манере.Примерно 50% гены с пониженной регуляцией не имеют канонической консенсусной последовательности Fur в их вышестоящие промоторные области. Точно так же мы не наблюдали привязки Белок меха к промоторным областям некоторых из этих генов. Существование железозависимого, независимого от меха регулирования привлекательно и заслуживает дальнейший экспериментальный анализ. В этом контексте недавно сообщалось что рост Pseudomonas aeruginosa и Pasteurella multocida в присутствии железа также приводит к увеличению экспрессия высокой доли генов (34, 35).Однако шкатулка из меха была наблюдается только в подгруппе регулируемых P. aeruginosa генов, предполагая участие дополнительных регуляторных белков в регуляции гены, регулируемые железом.

Связывающая последовательность белка Fur постоянно пересматривалась несколько исследователей и был предметом бурных споров. de Lorenzo et al. (36) предложили 19-бп. консенсус, основанный на анализе DNaseI. Кроме того, анализ 33 генов промоторы, идентифицированные как железо и мех, регулируемые методом титрования меха выявили аналогичный консенсус из 19 пар оснований (10).А 21-п.н. Консенсус Neisseria , который на ≈80% гомологичен E. coli был получен консенсус и предложен в качестве связывающей последовательности протеина Neisseria Fur (23). Хотя 19- и Консенсусы из 21 п.н. служат хорошими индикаторами для идентификации гена с регуляцией Fur, Fur-связывающая последовательность идентифицирована в промоторах нескольких Fur-регулируемых гены отличались от классической Fur-связывающей последовательности (37–42). В свете этих результатов Fur-связывающая последовательность была переинтерпретирована как быть комбинацией из трех повторов 6-bp 5′-NAT (A / T) AT-3 ‘скорее чем палиндром из 19 п.н. (24).Наличие гексамерных повторов с различной степенью гомологии может позволить для связывания меха с различным сродством, что позволяет регуляция Fur-зависимых генов (6, 12, 24). Недавние исследования Гены, регулируемые мехом в B. subtilis , предположили, что перекрывающиеся Мотив гептамера 7-1-7 — минимальная единица распознавания для меха с высоким сродством переплет (43, 44). Наше выравнивание промотор-проксимальные области железа N. meningitidis и Гены, регулируемые мехом, идентифицированные в этом исследовании, позволяют предположить, что гексамерный повтор 5’NATW (A / T) AT 3 ‘представляет собой Fur-связывающую единицу и находится в согласие с предложенным требованием о трех минимальных повторяющихся единицах для эффективный меховой переплет (24).

Хотя компьютерные прогнозы и анализ EMSA позволяют идентификации Fur-связывающих областей, следует соблюдать осторожность при назначении a priori биологическое значение этих результатов. Действительно, ни один анализ не касается сродства меха к конкретному промотору / оператору регионах или, в конечном итоге, соответствующая функция этих взаимодействий в vivo . В этом контексте интересно отметить, что когда вышестоящие области 600 нечувствительных к железу генов были подвергнуты компьютерной анализ с использованием консенсуса Fur-box, определенного в этом исследовании, 31% генов по-видимому, несет предполагаемый сайт связывания с мехом.Хотя этот процент статистически ниже, чем 51% частота, обнаруженная в генах, регулируемых железом (см. Результаты ), он все еще очень высокий. Высокий процент Меховые ящики вблизи генов, нечувствительных к регуляции железа, могут быть объяснено, если предположить низкое сродство меха к этим регионам.

Используя иерархический кластерный анализ, мы смогли сгруппировать Neisseria железо-регулируемых генов в кластеры генов, имеющие сходные транскрипционная активность на протяжении всего цикла роста.Затем мы проверили, действительно ли были кластеры, содержащие только гены со связывающими Fur последовательностями. Действительно, был создан кластер генов, состоящий исключительно из Fur-связывающих генов. Гены этой группы характеризуются профилем экспрессии постоянного подавление регуляции, которое для некоторых генов было всего 10-кратным и никогда <1,5 раза по сравнению с экспрессией в условиях избытка железа. Учитывая, что 32 из 68 транскрипционных единиц с пониженной регуляцией были подвергнуты анализу сдвига геля и что предыдущие исследования продемонстрировали Fur-связывающая активность 5 дополнительных транскрипционных единиц с подавлением регуляции (17, 18), этот анализ, по-видимому, быть мощным инструментом для прогнозирования генов, регулируемых мехом (доступны данные о гелевом сдвиге). 46 генов, что соответствует 58% всех генов с пониженной регуляцией).Учитывая что в промоторной области некоторых из этих генов канонический Fur-box последовательность не может быть распознана, кластерный анализ, а не Fur-box прогнозирование, по-видимому, является наиболее надежным подходом к прогнозированию Меховая активность. Наш гель-сдвиг и кластерный анализ также показали, что существуют гены, связывающие Fur, но принадлежащие к разным кластерным семействам. Один Возможная интерпретация этих результатов заключается в том, что при экспериментальном В используемых условиях на транскрипцию этих генов влияют, помимо Мех, другие регулирующие факторы.Если это будет экспериментально продемонстрировано, кластерный анализ станет особенно полезным для выяснения новых механизмов регуляции гена железа с участием более чем одного регуляторного белка.

Благодарности

Мы благодарим Сарику Агарвал, Бориса Шмигельски, Серджио Баллони, Клаудио Донати, В. Масиньяни и М. Скарселли за помощь в компьютерном анализе, Изабель Делани за полезные обсуждения, Филиппо Рандаццо и Джоэля Бергера за определение и конструирование микрочипов, а также A.Майорино для опытных секретарей помощь. Это исследование было поддержано грантами службы общественного здравоохранения U19AI. 38515 и AI48611 (для C.A.G.).

Сноски

  • ↵¶ Кому следует обращаться по адресу: Отделение медицины, секция инфекционных болезней, Медицинский факультет Бостонского университета, 650 Олбани Street, Boston, MA 02118. Электронная почта: caroline.genco {at} bmc.org.

  • ↵ † Р.Г. и С.С. в равной степени внесли свой вклад в эту работу.

  • Сокращение: EMSA, анализ сдвига электрофоретической подвижности.

  • Поступило 6 января 2003 г.
  • Copyright © 2003, Национальная академия Sciences

Расшифровка регуляторной сети транскрипции Fur подчеркивает ее сложную роль, выходящую за рамки метаболизма железа в Escherichia coli

Идентификация сайтов связывания Fur в масштабе всего генома

Ранее сайты связывания Fur в E.coli охарактеризованы с помощью экспериментов по связыванию ДНК in vitro и анализа связанных мутаций 8,11 ; однако прямое измерение связывания с мехом in vivo недоступно. Поэтому мы сначала применили метод ChIP-exo для определения карт связывания in vivo Fur с разрешением около 1 п.н. в E. coli как при избытке железа (0,1 мМ FeCl 2 ), так и при голодании железа (0,2 мМ 2,2′-дипиридил) 12,13,14 условиях (рис.2а и дополнительный рис. 1). Кроме того, мы также исследовали активные сайты транскрипции на геноме E. coli с помощью ChIP-экзо-анализа РНКП как в статических (с рифампицином, который блокирует элонгацию транскрипции), так и в динамических (без рифампицина) условиях.

Рисунок 2: Распределение сайтов связывания Fur по всему геному.

( a ) Обзор профилей связывания Fur в геноме E. coli на средней фазе экспоненциального роста как в условиях избытка железа (красный), так и в условиях голодания (синий).Черные и белые точки обозначают ранее известные и недавно обнаруженные сайты связывания Fur, соответственно. S / N обозначает отношение сигнал / шум. (+) и (-) обозначают прямое и обратное чтение соответственно. ( b ) Перекрытие между сайтами связывания меха в условиях избытка железа и голодания по железу. ( c ) Сравнение сайтов связывания Fur, полученных в этом исследовании (ChIP-exo), с литературной информацией.

Используя алгоритм поиска пиков (программа MACE), 143 и 61 воспроизводимые пики связывания Fur были идентифицированы в условиях избытка железа и голодания по железу, соответственно (рис.2а и дополнительные данные 1). Количество событий связывания было таким же, как и у других глобальных TF, таких как ArcA, Crp, Fnr и Lrp 15,16,17,18 . Высокое разрешение метода ChIP-exo позволило нам идентифицировать множественные пики связывания в нескольких сайтах связывания и отдельные пики связывания в расходящихся промоторных областях (дополнительный рис. 2). В общей сложности 118 и 59 сайтов связывания с мехом, где некоторые сайты содержат множественные пики, были идентифицированы в условиях избытка железа и недостатка железа, соответственно.Большинство сайтов связывания (58 из 59) в условиях голодания по железу перекрывались с сайтами в условиях избытка железа, таким образом давая общее количество сайтов связывания, равное 119 (рис. 2b). Одним интересным исключением была область выше по течению от ycgZ ymgA ariR ymgC , где Fur занимал только в условиях голодания по железу, что указывает на возможную прямую регуляцию со стороны Fur в этих условиях. Только 54% ​​сайтов связывания (64 из 119) были расположены в предполагаемых регуляторных областях (промоторы и 5′-проксимальные к кодирующим областям), а остальные 46% были обнаружены во внутригенных областях или между двумя кодирующими областями конвергентных генов.Основываясь на картах связывания RNAP, мы могли подтвердить, что связывание Fur на аннотированных нерегуляторных областях не было связано с активными событиями транскрипции (Supplementary Fig. 3). Перед этим исследованием 27 участков связывания с мехом были идентифицированы с убедительными экспериментальными доказательствами 8,11 , 74% (20 из 27) из которых также были обнаружены в этом исследовании (рис. 2c и дополнительная таблица 1). В совокупности в этом исследовании было обнаружено 98 сайтов связывания Fur, 45% (44 из 98) из которых расположены в предполагаемых регуляторных областях (рис.2c), расширяя текущий объем регулирующей сети Fur.

Полногеномная реконструкция регулона Fur

В настоящее время в общей сложности 70 генов в 27 единиц транскрипции (TU) были охарактеризованы как члены регулона Fur, которые непосредственно регулируются Fur в E. coli на основании убедительных экспериментальных данных. 8,11 . На основе нашего анализа ChIP-exo мы значительно увеличили размер потенциального регулона Fur, включив 110 генов-мишеней в 64 TU. Чтобы определить причинную связь между связыванием Fur и уровнем транскрипта, мы сравнили уровни транскриптов между клетками дикого типа и мутантными клетками Δ fur , выращенными как в условиях избытка железа, так и в условиях голодания (дополнительный рис.1). В целом 678 генов дифференциально экспрессировались с изменением в log2 раза> 0,5 и коэффициентом ложного обнаружения (FDR) <0,01 за счет делеции Fur либо в условиях избытка железа (553), либо в условиях железного голодания (211), 86 из которых перекрывались в оба условия (дополнительный рисунок 4 и дополнительные данные 2 и 3).

Объединив наши результаты ChIP-exo карт связывания Fur с данными Fur-зависимого транскриптома, мы смогли прояснить гены-мишени для прямой регуляции Fur в зависимости от доступности железа.Всего 81 ген в 42 TUs напрямую регулируется Fur либо в условиях избытка железа (77 генов), либо в условиях железного голодания (4 гена) (рис. 3a, b и дополнительные данные 1 и дополнительная таблица 2). Эти гены были помещены в кластеры категорий ортологичных групп (COG) в соответствии с их функциональной аннотацией (рис. 3c). Как и ожидалось, категория COG для транспорта и метаболизма неорганических ионов (P) оказалась статистически избыточной (гипергеометрическое значение P <0,05).Кроме того, две другие категории для производства и преобразования энергии (C) и транспорта и метаболизма вторичных метаболитов (Q) также были перепредставлены ( P -значение <0,05). Разнообразный диапазон функциональных категорий COG указывает на то, что Fur может играть сложные регуляторные роли, помимо метаболизма железа, для координации связанных клеточных процессов. Мы также обнаружили, что 30 из 81 гена в прямом регулоне Fur регулируются 23 другими TF (дополнительная таблица 3). Интересно, что гены, участвующие в системе suf для сборки кластеров железо-сера, регулируются дополнительными пятью TF (OxyR, NsrR, IscR, IhfB и IfhA), что свидетельствует о важности жесткой регуляции этого оперона в зависимости от различных изменений окружающей среды.Остающийся 51 ген не регулируется другими TF, это означает, что Fur регулирует исключительно эти гены в ответ на доступность железа.

Рисунок 3: Полногеномная идентификация регулона Fur.

Сравнение результатов ChIP-exo и профилей экспрессии генов в условиях ( a ) насыщенных железом и ( b ) железных голоданий для различения прямого и непрямого регулона Fur. ( c ) Функциональная классификация генов, непосредственно регулируемых Fur. Звездочка указывает гипергеометрическое значение P <0.05.

597 генов, которые были Fur-зависимыми генами, но не являлись прямым регулятором Fur (рис. 3a, b), могли бы стать мишенями для непрямой регуляции Fur (опосредованной малой РНК RyhB), других чувствительных к железу ТФ или другие стресс-чувствительные TF, поскольку доступность железа может вызывать различные типы повреждений, такие как окислительно-восстановительный дисбаланс и окислительный стресс 19 . Как и ожидалось, ни одно из событий связывания Fur в нерегулирующих областях, где мы подтвердили, что активная транскрипция не происходила на основе данных RNAP ChIP-exo, существенно не изменило уровень транскрипции соответствующих генов-мишеней (изменение в 2 раза больше, чем в логарифмическом масштабе <0.5 и FDR> 0,01). Кроме того, мы обнаружили, что 95% (55 из 58) перекрывающихся областей связывания, где Fur связывается независимо от доступности железа, не были существенно связаны с регуляцией транскрипции (log2-кратное изменение <0,5 и FDR> 0,01, дополнительные данные 1).

Регулирующие режимы меха в зависимости от наличия железа

Интересным аспектом регулирующих режимов меха является его переменная реакция на доступность железа. Классическая регуляция Fur включает связывание связанного с железом Fur с промоторной областью в качестве репрессора; однако недавние исследования показали случаи, когда Fur действует как активатор 3,4 или как оба, даже в отсутствие его кофактора железа у некоторых патогенных видов 1,5,6 .Чтобы определить режимы регуляции Fur в E. coli , мы классифицировали регуляцию 81 гена, который напрямую регулируется Fur, на три различных режима (HR, HA и активация апо -Fur) в зависимости от изменений уровней транскриптов. и Меховая вязка с утюгом и без него.

Например, промоторные области fepA и fes TU, где существуют два расходящихся промотора, были в значительной степени заняты Fur в условиях насыщения железом, и это связывание значительно снижало уровни транскриптов в этих условиях (рис.4а, HR). Мы обозначили этот режим регулирования как HR. В общей сложности 65 генов регулировались этим способом, и 23 из них были ранее исследованы с помощью слабых доказательств, таких как сравнительный транскриптомный анализ ( fiu-ybiX , efeUOB , fhuE , yncE , yddA-yddB , ydiE , nrdHIEF , yqjH и feoABC ) или отсутствие доказательств ( ybaN , adhP , ynfD , yoeA и )Интересно, что оперон efeUOB , который кодирует комплекс транспортера двухвалентного железа, все еще репрессируется с помощью связанного с железом Fur, даже несмотря на то, что этот оперон является загадочным из-за мутации сдвига рамки считывания 20 . Расчет относительного расстояния от Fur-связываний до сайта начала транскрипции (TSS) 8,11,21 показал, что Fur-связывания локализованы вокруг областей связывания RNAP (дополнительный рис. 5a и дополнительные данные 1). Как уже известно, прямая репрессия транскрипции с помощью Fur, по-видимому, достигается за счет исключения связывания RNAP из-за занятости Fur в этой области.

Рисунок 4: Режимы регулирования отдельных открытых рамок считывания, управляемые Fur, в зависимости от доступности железа.

( a ) Примеры режима holo -Fur репрессии (HR) ( fepA-entD и fes-ybdZ-entF-fepE ), holo -Fur режима активации (HA) ( ftnB и ftnA ) и апо -Режим активации меха (AA) ( ycgZ-ymgA-ariR-ymgC ). S / N обозначает отношение сигнал / шум. (+) и (-) в данных ChIP-exo обозначают чтение в прямом и обратном направлении соответственно.Прямоугольники с пунктирными линиями представляют собой увеличенные примеры на дополнительном рис. 2. ( b ). Изображение последовательности логотипов профилей связывания Fur-ДНК с консенсусной последовательностью, выделенной стрелками. H-Reg-R, holo — Репрессия меха; H-Reg-A, holo -Активация меха; H-Reg-N, holo -Fur-связывающие пики в регуляторных областях, но без изменения уровня транскрипта; H-NoReg-N, holo -Fur-связывающие пики в нерегулирующих областях; B-Reg-N, пики связывания независимо от наличия железа в регуляторных областях, но без изменения транскрипта; B-NoReg-N, пики связывания независимо от наличия железа в регионах, не регулирующих правила.

Напротив, ассоциации Fur на ftnB и ftnA TUs увеличивали уровни транскриптов в условиях избытка железа (Fig. 4a, HA). Таким образом, мы обозначили этот режим регулирования как HA. В предыдущем исследовании только ftnA считалось прямой мишенью для активации за счет связывания Fur в области выше промотора для предотвращения связывания других репрессоров 4 . Тем не менее, мы идентифицировали еще 11 генов-мишеней ( argF-yagI , adk , ftnB , hybOA , zapB , uxuAB , acnA и ydjiT -прямая активация железом) для связывания Мех (дополнительные данные 1).Большинство из них используют железо ( ftnB , hybOA , uxuA и acnA ) или ионы других двухвалентных металлов ( argF , adk и uxuB ) в качестве кофакторов или активаторов. Хотя аконитаза, кодирующая acnA , которая катализирует взаимное превращение цитрата и изоцитрата в цикле TCA и воспринимает железное голодание и окислительный стресс, как известно, косвенно регулируется Fur через RyhB-опосредованную деградацию мРНК 10 , она также напрямую активируется. железными мехами.Это наблюдение согласуется с анализом нозерн-блоттинга из предыдущего исследования, где двойной мутант Δ ryhB Δ fur показал гораздо меньшее количество транскрипта acnA по сравнению с мутантом Δ ryhB , предположительно из-за потери прямого активация мехом 10 . В этом случае Fur связывается с сайтами выше или ниже промоторной области, в отличие от сайтов HR, где Fur связывается с участками связывания RNAP (дополнительный рис.5b и дополнительные данные 1). Это предполагает, что Fur может предотвращать связывание других репрессоров, как в случае ftnA 4 , или напрямую активировать транскрипцию с помощью дополнительных механизмов, таких как рекрутирование RNAP 3,22 для активации транскрипции.

Другой аспект меха — его регуляция, опосредованная связыванием его безжелезной формы у некоторых видов патогенных бактерий 1,5,6 . Хотя считалось, что E. coli K-12 MG1655 не имеет этого регуляторного режима, мы наблюдали, что промоторная область оперона ycgZ-ymgA-ariR-ymgC связывается с Fur только в условиях железного голодания, и это связывание сопровождалось увеличением уровня транскрипта (рис.4а, апо — активация меха). Мы обозначили этот регуляторный режим как активация апо -Fur (AA). Основываясь на вычислении расстояния от связывания Fur с TSS (-74 относительно TSS), мы полагаем, что активация апо -Fur этого оперона также может происходить либо путем предотвращения связывания других репрессоров, либо путем прямого рекрутирования RNAP (дополнительные данные 1). Три гена ( ymgA , ariR и ymgC ) в этом опероне связаны с образованием биопленок, и один из них ( ariR ) также связан с кислотостойкостью 23 .Таким образом, мех может играть ключевую роль в подавлении образования биопленок и устойчивости к кислотному стрессу, активируя этот конкретный оперон в условиях железного голодания. Мы не наблюдали регуляторный режим репрессии апо -Fur (AR) для любой TU в E. coli K-12 MG1655, хотя некоторые патогенные штаммы, как сообщалось, имели этот режим 1,5,6 .

Для дальнейшего анализа последовательностей отдельных сайтов связывания Fur мы создали шесть различных наборов данных с последовательностями отпечатков на основе режимов связывания Fur (с железом или без него), мест связывания (регуляторная или нерегуляторная область) и изменения транскрипта. уровень (репрессия, активация или отсутствие изменений в уровне транскрипта) следующим образом: 46 пиков связывания в HR (H-Reg-R), 11 пиков связывания в HA (H-Reg-A), 9 holo -Fur-связывающих пиков в регуляторных областях, но без изменений в уровне транскрипта (H-Reg-N), 19 holo -Fur-связывающих пиков в нерегулирующих областях (H-NoReg-N), 13 пиков связывания независимо от доступности железа в регуляторных областях, но отсутствие изменений в транскрипте (B-Reg-N) и 45 пиков связывания независимо от доступности железа в нерегулирующих областях (B-NoReg-N).Мы также произвольно увеличили последовательность каждого сайта на 20 нуклеотидов на каждом конце, чтобы позволить соседним последовательностям быть включенными в процедуру поиска мотивов 24 . Поиск мотивов для генов, репрессированных holo -Fur, дал консенсусную последовательность (TRAKAAYSATTATYA) с каноническими блоками Fur, содержащими внутреннюю палиндромную последовательность 7-1-7 (TGATAATnATTATCA) 25 (рис. 4b, H-Reg-R). . Напротив, идентифицированные мотивы для генов, активируемых holo -Fur (TGAGAWTGATWHKCM; рис.4b, H-Reg-A), holo -Fur-связывающие сайты в регуляторных областях без изменения уровня транскрипта (TGADAWTGATTHTCA; рис. 4b, H-Reg-N) и сайты в нерегулирующих областях (YGAKAWYVDTTMTCA; рис. 4b , H-NoReg-N) также были подобны ранее идентифицированным коробкам Fur, но имели относительно слабую палиндромную последовательность с разнообразием последовательностей, как выявлено в исследовании ftnA 4 . Интересно, что в двух других случаях, когда Fur связывается независимо от доступности железа с любым регулятором (TGAKARY; рис.4b, B-Reg-N) или нерегуляторные (TGAGAAT; рис. 4b, B-NoReg-N) области напоминали только половину ранее известных Fur-боксов. Консенсусная последовательность для режима AA не была идентифицирована, потому что она имела только один пик связывания. Поскольку известный апо -Fur-связывающий мотив (AATGA) специфичен только для AR, а не для апо -активации -Fur в Helicobacter pylori 5 , мы также не смогли найти аналогичный мотив в области связывание апо с мехом, которое стимулирует экспрессию (дополнительная таблица 4).

Поскольку данные о связывании TF по всему геному из экспериментов ChIP могут быть источником информации для вывода об относительной аффинности связывания ДНК этого белка in vivo 26 , мы присвоили отношение сигнал-шум (S / N) отношение каждого пика связывания Fur к in vivo относительной аффинности связывания каждого сайта (дополнительные данные 1). Чем больше последовательность связывания отличалась от консенсусного блока Fur, тем ниже стало относительное сродство связывания in vivo ( R 2 = 0.52; Дополнительный рис.6). Репрессированные гены holo (H-Reg-R) показали значительно более высокую относительную аффинность связывания in vivo по сравнению с другими связываниями holo -Fur (H-Reg-A, H-Reg-N и H-NoReg- N), а также неспецифические связывания меха (B-Reg-N и B-NoReg-N; дополнительный рис. 7; критерий суммы рангов Вилкоксона, P <0,01). Однако относительная аффинность связывания in vivo сайтов H-Reg-A была аналогична таковой для сайтов H-Reg-N и H-NoReg-N, что указывает на то, что аффинность связывания сама по себе не может быть единственной детерминантой относительно того, происходит ли регуляция. или нет 27 .Кроме того, два неспецифических сайта связывания (B-Reg-N и B-NoReg-N) показали значительно более низкую относительную аффинность связывания, чем другие четыре категории связывания holo -Fur, предположительно из-за присутствия только половины согласованный мотив на этих сайтах (дополнительный рис. 7; критерий суммы рангов Вилкоксона, P <0,01). Учитывая эти связывающие свойства Fur, вполне вероятно, что у Fur могут быть дополнительные неоткрытые функции, или эволюция была медленной, чтобы устранить эти неспецифические взаимодействия с низким сродством (половина согласованного мотива) для Fur, как показано в других случаях 15 , 16,27,28 .

Fur-регулируемые мотивы петли обратной связи для метаболизма железа

Затем мы реконструировали регуляторную сеть Fur в E. coli , чтобы наблюдать, как Fur регулирует гены метаболизма железа. После функциональной классификации 81 гена, непосредственно регулируемого Fur, мы обнаружили, что функции 53% (43 гена) этих генов в основном связаны с транспортом и метаболизмом железа. Чтобы идентифицировать метаболические пути, регулируемые Fur, члены Fur-регулона были сопоставлены с путями захвата / утилизации железа 2,8,9,29 (рис.5а). В условиях избытка железа Fur подавлял весь биосинтез / транспорт энтеробактина и системы транспорта железа или комплекса железа, включая fhuE , feoABC и fiu . С другой стороны, он активировал несколько ферментов, использующих железо, включая ftnB , uxuAB и hybOA в тех же условиях. Как показано в предыдущем исследовании, одна из систем сборки кластера FeS, опосредованная опероном suf , напрямую регулируется Fur, тогда как другая, опосредованная опероном isc , косвенно регулируется Fur через RyhB-опосредованную деградацию мРНК 30 .Эта RyhB-опосредованная регуляция также заставляет гены, связанные с утилизацией железа, регулироваться в соответствии с внутриклеточным пулом железа ( sdhDC , fumA , bfr ).

Рис. 5: Пути приобретения / использования железа, непосредственно регулируемые Fur и регулирующим сетевым мотивом.

( a ) Представлены пути получения железа (биосинтез энтеробактина и транспорт железа / энтеробатина), утилизация железа (хранение железа и кофакторы железо / FeS) и пути сборки FeS.Гены, регулируемые HR и HA, обозначены красными и синими символами соответственно. Гены, регулируемые RyhB-опосредованной деградацией мРНК, обозначены зелеными символами с черными прямоугольниками. 2,3-ДХБА, 2,3-дигидроксибензойная кислота; IM, внутренняя мембрана; ОМ, наружная мембрана. ( b ) Схематическая диаграмма реконструкции регуляторного мотива Fur для метаболизма железа. Заштрихованные серые прямоугольники указывают петли мотивов, используемые E. coli K-12 MG1655 для метаболизма железа (мотивы петель отрицательной / отрицательной обратной связи, достигаемые с помощью режимов регуляции HR / HA).

На основе этого анализа мы смогли соединить пары петель обратной связи транспорта и использования 31 (рис. 5b). В левой петле Fur регулирует транскрипцию транспортного белка (Т) в присутствии или в отсутствие железа, облегчая захват железа (Fe 2+ из ), тогда как в правой петле Fur контролирует транскрипция ферментов утилизации железа (U), которые хранят Fe 2+ в или используют его в качестве кофакторов. Возможные логические структуры мотивов петель обратной связи могут быть охарактеризованы в зависимости от того, как Fur-Fe 2+ (или Fur) репрессирует или активирует как T, так и U.В нашем случае регуляторная сеть Fur показала пары петель отрицательных / отрицательных мотивов (- / -) для метаболизма железа, чтобы поддерживать внутриклеточную концентрацию железа путем репрессии транскрипции генов транспортеров железа (HR) и увеличения производства белков, использующих железо (HA ) в условиях насыщения железом (рис. 5б). Основываясь на этом правиле, мы предполагаем, что функция девяти Y-генов ( yncE , yddA-yddB , ydiE , yqjH , ybaN , ynfD , yoe1727 yojo) и непосредственно регулируемые с помощью режима HR могут быть вовлечены или в процессы транспортировки железо / железо-комплекса или в процессы приобретения железа, учитывая их предполагаемые функциональные аннотации в качестве переносчиков или мембранных белков 8,9 .Кроме того, появляется все больше доказательств того, что Fur у патогенных видов также имеют режим AA для транспортеров железа и режим AR для ферментов утилизации железа (дополнительная таблица 5). Поскольку другая пара петель отрицательных / отрицательных мотивов (- / -) также может быть достигнута путем регулирования генов-мишеней в режимах AA и AR (рис. 5b), эти патогенные виды могли эволюционировать, чтобы иметь дополнительные системы регуляции приобретения / утилизации железа для того, чтобы чутко реагировать на наличие железа.

Полногеномная характеристика регуляторной сети Fur показывает связь между деградацией катехолов и метаболизмом бациллибактина в Bacillus subtilis

Abstract

Регулятор захвата железа (Fur) является глобальным биосенсором железа во многих бактериях.Мех функционирует как активируемый железом репрессор транскрипции для большинства регулируемых им генов. Есть несколько примеров, когда holo-Fur прямо или косвенно активирует транскрипцию. Недавние исследования показывают, что апо-Fur может также действовать как положительный регулятор и, помимо метаболизма железа, Fur-регулон может охватывать другие биологические процессы, такие как синтез ДНК, энергетический метаболизм и образование биопленок. Здесь мы получили геномное представление регуляторной сети Fur в Bacillus subtilis с использованием ChIP-seq.Помимо известных сайтов-мишеней Fur, было идентифицировано 70 предполагаемых сайтов связывания ДНК, и подавляющее большинство из них имели более высокую занятость в условиях достаточного количества железа. Среди новых обнаруженных сайтов особый интерес представляет сайт связывания Fur в промоторной области оперона catDE . Этот оперон, кодирующий катехол-2,3-диоксигеназу, имеет решающее значение для деградации катехолов и находится под отрицательной регуляцией CatR и YodB. Эти три репрессора действуют совместно, регулируя транскрипцию catDE , при этом Fur функционирует как датчик ограничения железа, а CatR — как главный датчик катехинового стресса.Генетический анализ предполагает, что CatDE участвует в метаболизме катехолат-сидерофоров бациллибактина, особенно когда бациллибактин постоянно продуцируется и накапливается внутри клетки, потенциально образуя эндогенные токсичные производные катехина. Это исследование документирует роль разложения катехолов в метаболизме бациллибактина и предоставляет доказательства того, что катехол-2,3-диоксигеназа может детоксифицировать эндогенно продуцируемые субстраты катехинов в дополнение к ее более широко изученной роли в биоразложении ароматических соединений и загрязнителей окружающей среды.

Значение Многие бактерии синтезируют высокоаффинные хелаторы железа (сидерофоры). Получение железа, опосредованное сидерофором, является эффективной и широко используемой стратегией для удовлетворения потребностей бактерий в железе, необходимом для их клеток. Один известный класс сидерофоров использует катехолатные группы для хелатирования железа. B. subtilis бациллибактин, структурно похожий на энтеробактин (производимый кишечными бактериями), представляет собой сидерофор из трискатехолата, который после импорта гидролизуется до мономерных единиц с высвобождением железа.Однако окончательная судьба этих катехоловых соединений и их потенциальная токсичность ранее не были определены. Здесь мы выполнили полногеномную идентификацию сайтов связывания Fur in vivo и обнаружили связь между деградацией катехолов и метаболизмом бациллибактина в B. subtilis. Помимо своей роли в детоксикации катехолов в окружающей среде, катехол-2,3-диоксигеназа, кодируемая catDE , также защищает клетки от интоксикации эндогенными метаболитами катехолов, производными бациллибактина, в условиях ограниченного количества железа.Эти данные проливают свет на путь деградации и рециркуляцию предшественников катехолатных сидерофоров.

Введение

Железо является важным микроэлементом для большинства бактерий. Он необходим для многих биологических процессов, но в избытке может быть токсичным. Различные системы стресса, опосредованные железом, реагируют на изменения доступности железа в окружающей среде (1, 2). Ограничение железа побуждает системы сбора извлекать железо из окружающей среды и активирует системы для мобилизации и определения приоритетности использования железа (3).И наоборот, избыток железа вызывает системы накопления и оттока для поддержания нетоксичных уровней внутриклеточного свободного лабильного железа (4, 5). Эти реакции должны тщательно координироваться регуляторами, реагирующими на железо, чтобы обеспечить эффективный баланс железа в клетке. Регулятор захвата железа (Fur) является ключевым регулятором гомеостаза железа у многих бактерий (6, 7). Fur контролирует уровни внутриклеточного железа и регулирует транскрипцию систем поглощения, использования, хранения и оттока железа (7-9).

Реглон меха был охарактеризован у многих бактерий.У B. subtilis регулон меха состоит примерно из 29 оперонов, многие из которых участвуют в приобретении железа. Они кодируют механизм биосинтеза эндогенных сидерофоров (бациллибактин, BB) и системы поглощения элементарного железа, цитрата железа, BB и различных ксенозидерофоров, которые секретируются другими микробами (9). В общем, Fur функционирует как активируемый железом репрессор транскрипции для большей части своего регулона. В условиях избытка железа Fur связывается со своим кофактором Fe 2+ , и образующийся голо-Fur связывается со своими сайтами-мишенями и репрессирует транскрипцию своих генов-мишеней; при ограничении железа Fur теряет свой кофактор, а апо-Fur диссоциирует от ДНК, что приводит к дерепрессии его регулона.Недавние результаты показывают, что Furрегулон дерепрессируется тремя последовательными волнами (3). По мере того как клетки переходят от достаточного количества железа к дефициту, клетки Bacillus (i) увеличивают свою способность импортировать обычные формы хелатного железа, которые уже находятся в их среде, такие как элементарное железо и цитрат трехвалентного железа, (ii) вкладывают свою энергию в синтез своих владеют сидерофором BB и продуцируют высокоаффинные системы импорта, опосредованные сидерофором, для улавливания железа, и (iii) активируют малую РНК FsrA и ее белки-партнеры для приоритетного использования железа (3).

Помимо своей регуляторной роли репрессора транскрипции, holo-Fur может также прямо или косвенно активировать экспрессию генов (5, 10, 11). Например, у Escherichia coli Fur положительно регулирует экспрессию гена запаса железа ftnA , конкурируя с репрессором H-NS при повышенных уровнях железа (5), а Listeria mononcytogenes Fur активирует отток железа FrvA. для защиты клеток от интоксикации железом (10).Последние исследования предположили, что апо-Fur может также действовать как положительный регулятор (12) и, помимо метаболизма железа, регуляторон Fur может распространяться на другие биологические процессы, такие как синтез ДНК, энергетический метаболизм и образование биопленок (12-15). Эти данные побудили нас получить геномное представление о регуляторной сети Fur в ответ на доступность железа в B. subtilis. Помимо известных сайтов-мишеней Fur, 70 предполагаемых сайтов связывания ДНК были идентифицированы с помощью иммунопреципитации хроматина в сочетании с высокопроизводительным секвенированием (ChIP-seq).Обращает на себя внимание сайт связывания, расположенный в промоторной области оперона catDE . Этот оперон кодирует одноядерный фермент железа, катехол-2,3-диоксигеназу, который имеет решающее значение для деградации катехолов (16).

B. subtilis — почвенный микроб. В естественной среде обитания B. subtilis подвергается воздействию многих токсичных ароматических соединений, которые выделяются из разлагающихся растений, грибов, животных и промышленных отходов (17-19). Ароматические соединения являются одними из наиболее распространенных загрязнителей окружающей среды, и большинство из них окисляются до катехолов до того, как бензольные кольца расщепляются (20).Катехины устойчивы в окружающей среде и могут подвергаться широкому спектру химических реакций вне или внутри клетки: (i) комплексообразование с тяжелыми металлами, (ii) окислительно-восстановительный цикл и (iii) образование активных форм кислорода (АФК) в результате реакции. с ионами металлов и кислородом. Эти процессы могут повредить ДНК и белок, а также нарушить мембранный потенциал (21).

Катехолдиоксигеназы широко изучены на предмет их инициирующей роли в биодеградации катехинов, которые сами по себе являются обычными промежуточными продуктами разложения широкого спектра ароматических соединений (19).Наше наблюдение за сайтом связывания Fur, предшествующим оперону catDE , привело нас к гипотезе о том, что, помимо внешнего катехолового стресса, B. subtilis может столкнуться с угрозами со стороны эндогенных катехоловых соединений. В ответ на ограничение железа, B. subtilis синтезирует катехоловый сидерофор BB и экспрессирует системы захвата, опосредованные сидерофором, для преодоления дефицита железа. BB, структурно сходный с энтеробактином, первичным обнаруженным у грамотрицательных бактерий (22), синтезируется с помощью системы сборки нерибосомальной пептидной синтетазы (NRPS) (DhbACEBF) (23).BB секретируется основным транспортером суперсемейства-фасилитатора YmfD (24), который находится под регуляцией транскрипционного активатора Mta (24), регулятора семейства MerR системы переносчиков оттока нескольких лекарств. BB хелатирует трехвалентное железо с чрезвычайно высоким сродством (pFe ~ 10 -33 M в биологических условиях; (7)), и полученный комплекс трехвалентное железо-BB затем импортируется системой FeuABC-YusV (25). Железо-BB впоследствии гидролизуется эстеразой BesA с высвобождением железа, в результате чего образуются три BB-мономера (2,3-дигидроксибензоат-глицин-треонин) (25).Неизвестно, подвергается ли мономер BB дальнейшей обработке, но это и производные катехолсодержащие соединения потенциально токсичны и могут влиять на приспособленность клеток.

В этом исследовании мы демонстрируем, что holo-Fur действует как репрессор и работает совместно с двумя другими регуляторами, CatR и YodB, в регуляции транскрипции оперона catDE . Этот оперон индуцируется при стрессе катехинов или ограничении железа и сильно индуцируется, когда присутствуют оба условия. Кроме того, накопление эндогенных катехоловых соединений, производных BB, запускает лизис клеток, и для снижения токсичности требуется CatDE.Эти данные свидетельствуют о том, что CatDE участвует в метаболизме трискатехолатного сидерофора BB и обнаруживает связь между деградацией катехолов и метаболизмом бациллибактина у B. subtilis .

Результаты и обсуждение

Идентификация сайтов связывания Fur по всему геному с помощью ChIP-seq

Недавнее исследование показало, что в анаэробных условиях B. subtilis Fur может регулировать гены за пределами своего ранее определенного регулона (15). Более того, наши предыдущие полногеномные исследования регуляции Fur были сосредоточены на тех генах (при мониторинге с помощью анализа микрочипов), которые были дерепрессированы как у мутанта fur , так и в ответ на истощение запасов железа.Поскольку Fur может также действовать, чтобы активировать экспрессию генов, а некоторые мишени могли не быть представлены в микрочипе (который был сфокусирован на аннотированных ORF), мы здесь выбрали беспристрастный взгляд на определение сайтов, связанных с Fur in vivo под состояния как с высоким содержанием железа, так и с дефицитом железа с использованием ChIP-seq. Чтобы модулировать уровни внутриклеточного железа, мы использовали высокоаффинный экспортер FrvA Fe 2+ из L. monocytogenes , чтобы вызвать голодание по железу, как описано ранее (3, 10).Клетки Bacillus дикого типа (с C-концевым FLAG-тегированным мехом в его нативном локусе и индуцируемой IPTG эктопической копией frvA , интегрированной в локус amyE ) собирали для исследования через 0 и 30 минут после индукции IPTG. Мех-зависимая регуляция в условиях достаточного и дефицитного железа соответственно (см. Подробности в разделе «Материалы и методы»).

Fur-зависимое связывание в условиях дефицита железа

Анализ ChIP-seq выявил 89 и 27 воспроизводимых сайтов связывания Fur (отношение сигнал / шум, S / N ≥1.5) в условиях достаточного и дефицитного железа соответственно (рис. 1 и таблицы S3-S4). Большинство сайтов связывания (22 из 27), занятых в условиях дефицита железа, перекрываются с сайтами связывания в условиях достаточного количества железа, поэтому общее количество сайтов связывания составляет 94 (рис. 1B). Эти сайты могут представлять сайты, связанные с holo-Fur, которые обладают особенно высоким сродством и низкой скоростью диссоциации, или, возможно, сайты, которые могут быть заняты in vivo апо-Fur.

Рис. 1. Обзор профилей для крепления меха на B.subtilis в различных условиях железа.
  1. Данные ChIP-seq для B. subtilis Fur-зависимое связывание в условиях достаточного и недостаточного железа. Два биологических повтора были включены для каждого условия роста (Опыт 1 и Опыт 2). Показания показаны синим цветом с максимальным значением 1500 для всех пиков ChIP. Общее количество считываний для каждого образца указано слева. S / N обозначает отношение сигнал / шум для пикового вызова, как показано коричневым цветом.

  2. Большинство пиков ChIP (22 из 27), идентифицированных в условиях дефицита железа, перекрываются с пиками, обнаруженными в условиях достаточного количества железа.Большинство пиков (61 из 94) расположены в регуляторных регионах.

  3. Большинство известных сайтов связывания Fur из литературы (24 из 27) идентифицированы ChIP-seq за тремя исключениями. Среди всех новых идентифицированных сайтов связывания Fur 33 сайта расположены во внутригенных областях, а 37 сайтов расположены в регуляторных областях.

  4. Распределение пиков ChIP, относящихся к соотношению сигнал / шум. Для этого анализа использовалось самое высокое отношение сигнал / шум каждого пика ChIP среди всех четырех образцов.

Пять пиков ChIP специфичны для Fur в условиях дефицита железа и могут представлять аутентичные сайты, специфичные для апо-Fur (фиг. S1 и таблица S4). Один из этих сайтов расположен в промоторе оперона S477 ykoP (таблица S3), который кодирует возможную регуляторную РНК S477 и белок YkoP с неизвестной функцией. Предполагается, что этот оперон находится под негативной регуляцией множества регуляторов, включая Fur (9), ResD (15), NsrR (15) и Kre (26).Однако статистически значимый пик ChIP (значение P ≥ 0,05) был обнаружен только в одном из биологических повторений (таблица S3), что указывает на то, что регуляторная роль Fur в этом месте является неопределенной. Четыре других апо-Fur-специфических сайта расположены во внутригенных регионах, и занятость Fur на этих сайтах довольно низка (Fig. S1 и Table S4). Физиологическое значение связывания Fur на этих сайтах неясно. Однако пик ChIP, расположенный внутри ylpC (также известный как fapR ), очень близок к 5’-концу гена (рис.S1D). FapR функционирует как глобальный регулятор биосинтеза жирных кислот и хорошо сохраняется у грамположительных бактерий (27). Ген fapR находится под двойной регуляцией: негативной регуляцией самим FapR (28) и позитивной регуляцией регулятора чувствительности кворума ComA (29). Интересно, что данные транскриптома показывают, что экспрессия fapR в ~ 4-кратно повышена в нулевом мутанте fur по сравнению с WT (9), предполагая, что fapR может находиться под отрицательной регуляцией Fur в условиях дефицита железа.В целом, наши результаты показывают, что апо-Fur играет ограниченную роль, если вообще играет, в регуляции генов у B. subtilis. Однако связь между биосинтезом жирных кислот и гомеостазом железа заслуживает дальнейшего изучения.

Известные целевые сайты Fur, идентифицированные с помощью ChIP-seq

Большинство ранее определенных целевых сайтов Fur (24 из 27) были обнаружены in vivo с помощью анализа ChIP-seq (рис. 1 и таблица S3), который подтвердил модифицированный метод ChIP-seq в B.subtilis (см. подробности в разделе «Материалы и методы») и дополнительно подтвердили сайты связывания Fur, охарактеризованные in vitro с помощью анализа отпечатков ДНКазы 1 и транскриптома (9). Однако заполнение меха на промоторных сайтах pfeT , yfkM и ydhU / ​​2 ydhU / ​​1 не было обнаружено. Ген pfeT кодирует переносчик потока Fe 2+ , и его экспрессия активируется Fur только в условиях избытка железа (30), что, вероятно, является причиной того, что мы не смогли обнаружить связывание Fur на этом сайте в тестируемых условиях.Ген yfkM кодирует общий стрессовый белок, который находится под регуляцией SigB, а ярдов и ярдов / 1 являются двумя неактивными псевдогенами. Предыдущее исследование обнаружило только очень слабое связывание Fur на промоторных сайтах yfkM и ydhU / ​​2 ydhU / ​​1 in vitro , и бокс Fur, идентифицированный на этих двух сайтах, соответствует только 10 из 15 оснований минимальная консенсусная последовательность 7-1-7 (9, 31). Эти результаты, вместе с отсутствием измеримой занятости Fur in vivo , предполагают, что Fur может не играть существенной роли в регуляции этих генов.

Пики ChIP, расположенные во внутригенной области

Многие из предполагаемых сайтов связывания Fur, идентифицированных с помощью ChIP-seq (29 из 70 сайтов), расположены во внутригенных областях (Таблица S4). Экспрессия большинства этих генов не регулируется Fur (сравнивая уровни мРНК между мутантом fur и диким животным), что отслеживается с помощью анализа микроматриц (9) и кПЦР (таблица S4 и таблица S5), что указывает на очевидное отсутствие физиологической значимости эти сайты. Затем мы оценили возможное участие некоторых предполагаемых целей в гомеостазе железа, будь то интоксикация железом или ограничение.Среди пяти протестированных целей (те, которые связаны с высокой степенью занятости меха, т.е. ppsB , gidA , tufA , ybaC и yycE ), ни одна из них не показала чувствительность к высокому содержанию железа; только нуль-мутант gidA показал умеренную чувствительность к дипиридилу по сравнению с WT. Ген gidA кодирует фермент модификации тРНК уридин-5-карбоксиметиламинометил, и его роль в гомеостазе железа в настоящее время изучается.

Другой известный кандидат на функциональный внутригенный Fur-связывающий сайт находится в пределах ppsB , второго гена в длинном опероне, кодирующем нерибосомную пептидную синтетазу (NRPS), которая синтезирует антибактериальное соединение плипастатин (липопептид, тесно связанный с фенгицинами) (32).У этого пика самая высокая занятость Fur среди всех вновь идентифицированных участков (Таблица S4). Промотор и два сайта начала транскрипции в противоположных направлениях были назначены перекрывающими этот пик ChIP (33), предполагая, что транскрипция инициируется изнутри в ppsB . Кроме того, предполагаемый ящик Fur был идентифицирован в пределах этой области пика (11 из 15 оснований, совпадающих с согласованной последовательностью) (таблица S5). Данные транскриптома показали, что экспрессия ppsB в ~ 3-кратно подавлена ​​в нуль-мутанте fur по сравнению с WT, хотя этот результат не был подтвержден кПЦР (таблица S5).Нулевой мутант ppsB не показал значительной чувствительности ни к интоксикации железом, ни к ограничению по сравнению с диким животным (таблица S5). Однако многочисленные исследования подтверждают важную стимулирующую роль железа в производстве липопептидов в Bacilli (34, 35), а липопептиды могут хелатировать ионы металлов (36) и, вероятно, железа. Вместе эти результаты приводят нас к предположению, что транскрипты, кодируемые в пределах ppsB , могут регулироваться с помощью Fur и, возможно, функционировать, чтобы координировать синтез плипастина со статусом железа.

Пики ChIP расположены в регуляторных областях

Среди 70 предполагаемых сайтов-мишеней Fur, идентифицированных с помощью анализа ChIP-seq, 37 расположены в регуляторных областях (Fig. 1C-D, Table S4). Большинство из этих сайтов связывают Fur в условиях достаточного количества железа, хотя Fur также связывается на некоторых сайтах по крайней мере в одной из биологических реплик в условиях дефицита железа (Таблица S4). По крайней мере, двенадцать из них имеют хорошие коробки меха, соответствующие минимальной консенсусной последовательности 7-1-7 (таблица S5). Интересно, что Fur связывается с промоторной областью gntR железо-независимым образом: занятость Fur в этом сайте остается примерно на том же уровне либо в условиях дефицита железа, либо в достаточных условиях (Таблица S4).

Чтобы оценить участие этих предполагаемых мишеней Fur в гомеостазе железа, мы сконструировали делеционные мутанты из двенадцати лучших кандидатов и провели анализы для проверки их чувствительности к высоким уровням железа и дипиридила (Таблица S5). Ни один из них не показал значительной чувствительности к высокому содержанию железа. Пять из них показали умеренную чувствительность к дипиридилу, в том числе cspB , yhcJ , catD , narJ и yybN (таблица S5). Данные транскриптома предполагают, что экспрессия cspB , catD и narJ может регулироваться Fur (3).Экспрессия catD повышается (3.3), тогда как экспрессия cspB (0.3) и narJ (0.2) подавляется в нулевом мутанте fur по сравнению со штаммом WT (Таблица S5). Регуляторная роль Fur в catD и narJ была дополнительно подтверждена количественной оценкой мРНК с использованием qPCR (Таблица S5). Здесь бицистронный оперон catDE подвергся дальнейшему исследованию, чтобы понять его физиологическую роль в гомеостазе железа.

Мех связывается с регуляторным сайтом оперона

catDE при достаточных условиях железа.

Воспроизводимый пик ChIP был идентифицирован в области промотора оперона catDE при достаточных условиях железа. Отношение сигнал / шум для вызова пика относительно высокое как в независимых повторах (10,1 для Exp.1 и 14,1 для Exp. 2; рис. 2 и таблица S4), так и в обогащении ChIP ДНК на этом участке по сравнению с входящей ДНК. контроль, является статистически значимым (P-значение 3.5 × 10 −24 для Exp. 1 и 1,2 × 10 −44 для Exp 2; Таблица S4). Оперон catDE кодирует предполагаемую катехол-2,3-диоксигеназу, для которой в качестве кофактора требуется Fe 2+ (16). CatE продемонстрировал активность 2,3-диоксигеназы in vitro и необходим для жизнеспособности в присутствии катехола (16, 37).

Рис. 2. Мех связывается с промоторной областью оперона catDE в условиях избытка железа.

Увеличенный пример связывания меха на рабочем месте catDE , идентифицированном ChIP-seq.Две биологические копии были включены как Exp.1 и Exp.2 для каждого условия. В этой области был аннотирован единственный пик для обоих повторов в условиях достаточного количества железа. Длина пика для Exp. 1 и 355 п.н. для Exp. 2. Никакие пики не были аннотированы в этой области ни для одной из реплик в условиях дефицита железа. S / N обозначает отношение сигнал / шум для пикового вызова.

Мы проверили чувствительность одиночных ( catD или catE ) или двойных мутантных ( catDE ) штаммов к токсичности катехинов, используя как дисковый диффузионный анализ, так и анализ роста биоскринов.Наши результаты подтвердили, что они оба участвуют в детоксикации катехинов (рис. S2). Оба анализа были выполнены в минимальной среде Белицкого, потому что мы заметили, что токсичность катехолов значительно снижена в среде LB (рис. S3), вероятно, по крайней мере частично из-за комплексов металл-катехол, образованных с Fe, Cu, Mn и другими ионы двухвалентных металлов, которые присутствуют в среде LB (рис. S4).

Регулирование оперона

catDE тремя регуляторами

Оперон catDE находится под отрицательной регуляцией CatR, регулятора транскрипции семейства MarR / DUF24, который воспринимает катехолы, и YodB, регулятора генов, важных для детоксикации хинона и диамида (16).Кроме того, Fur-бокс (13 из 15 оснований соответствуют минимальной консенсусной последовательности 7-1-7; (31)) расположен ниже сайта начала транскрипции (рис. 3A), что позволяет предположить, что Fur может действовать как репрессор. Действительно, измерения кПЦР показывают, что экспрессия catD была повышена в ~ в 4 раза в нуль-мутанте fur по сравнению с клетками дикого типа (рис. 3C), что согласуется с предыдущим анализом транскриптома (9).

Рис. 3. Регулирование оперона catDE тремя факторами транскрипции
  1. Промоторная последовательность оперона catDE : –10, –35 и сайт начала транскрипции (+1) выделены синим цветом; два блока CatR обозначены оранжевыми стрелками; поле YodB обозначено голубой стрелкой; Коробка «Мех» подчеркнута.

  2. Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) проводили для определения аффинности связывания Fur-ДНК с промоторной областью оперона catDE . Эксперименты были повторены трижды, и показано типичное изображение.

  3. Уровни мРНК catD сравнивали среди различных штаммов, выращенных в среде LB без или со 100 мкМ дипиридила, используя кПЦР.

  4. Уровни мРНК catD сравнивали среди различных штаммов, выращенных в минимальной среде Белицкого без или с 2 мМ катехола, с помощью кПЦР.Ген 23S рРНК использовали в качестве внутреннего контроля как для C, так и для D.

Мы использовали анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) для определения сродства Fur к catDE операторскому сайту in vitro. Удивительно, но в отличие от очень высокого сродства (K d ~ 0,5-5,6 нМ), наблюдаемого для связывания Fur с большинством его известных сайтов-мишеней (3), сродство Fur к промотору catDE довольно низкое ( К d ~ 0.7 мкМ). Однако это сродство сопоставимо со сродством связывания CatR или YodB с одним и тем же промоторным участком (16), и все они, по-видимому, связываются довольно слабо при индивидуальном тестировании. Это предполагает, что, возможно, эти три регулятора взаимодействуют друг с другом и совместно связываются с промоторным сайтом.

Чтобы проанализировать кооперативность между тремя регуляторами in vivo , было проведено генетическое исследование с использованием мутантов с одиночной, двойной и тройной делецией этих трех регуляторов, и уровни мРНК catD были количественно определены в различных стрессовых условиях: железо ограничение и катехоловый стресс.В соответствии с предыдущим исследованием (16) CatR функционирует как главный регулятор, а YodB играет второстепенную роль в регуляции оперона catDE (рис. 3C-D). Когда присутствует только один регулятор (у двойных мутантов), репрессия YodB (у двойного мутанта fur catR ) приводила к ~ 4-кратному снижению мРНК по сравнению с полной дерепрессией, наблюдаемой у тройного мутанта ( fur catR yodB ). CatR является основным репрессором и отвечает за ~ 38-кратное снижение экспрессии catD (сравнение двойного мутанта fur yodB с тройным мутантом fur catR yodB ).Интересно, что уровень мРНК catD в двойном мутанте catR yodB сравним с таковым в тройном мутанте, что указывает на то, что Fur играет незначительную регуляторную роль, когда оба CatR и YodB отсутствуют, и связывание Fur на этом сайте in vivo может потребоваться или при содействии двух других регулирующих органов.

Либо CatR, либо YodB облегчают связывание меха на промоторном сайте

catDE

Для дальнейшего изучения того, способствуют ли CatR и / или YodB связывание меха in vivo , заполняемость меха на промоторном сайте catDE оценивали с помощью ChIP -qPCR.Не наблюдалось заметного изменения занятости Fur у одиночного мутанта catR по сравнению с клетками дикого типа, в то время как занятость Fur значительно увеличилась у одиночного мутанта yodB (рис. 4A), что указывает на то, что Fur взаимодействует с CatR более эффективно, когда YodB является отсутствующий. Это согласуется с данными экспрессии, которые показали, что catD был индуцирован дипиридилом в одиночном мутанте catR до уровня, сравнимого с уровнем, наблюдаемым у двойного мутанта fur catR , тогда как дипиридил только частично дерепрессировал его. одиночный мутант yodB по сравнению с двойным мутантом fur yodB (рис.3С). Интересно, что занятость Fur значительно снижается, когда оба регулятора отсутствуют у двойного мутанта catR yodB (фиг. 4A). Как и ожидалось, ни CatR, ни YodB не влияли на занятость Fur на промоторе dhbA (фиг. 4B). Эти результаты предполагают, что CatR и в меньшей степени YodB способствуют связыванию Fur в промоторной области catDE. Сходным образом, NsrR и ResD, как сообщается, способствуют связыванию Fur в меньшинстве совместно регулируемых сайтов в анаэробных условиях; в большинстве случаев связывание сайтов было конкурентным (15).На очевидно совместных сайтах ( ykuN , fbpC и exlX / yoaJ ), Fur, по-видимому, облегчает связывание NsrR и / или ResD.

Рис. 4. Либо CatR, либо YodB облегчают связывание меха на промоторном сайте catDE.

Заселенность меха оценивали методом иммунопреципитации хроматина (ChIP) с использованием антител против FLAG. Коиммунопреципитированная ДНК количественно определялась с помощью КПЦР. Обогащение ДНК рассчитывали на основе введенной ДНК (1% от общей ДНК использовался для каждого эксперимента с ChIP).Данные представлены как кратное увеличение занятости Fur на промоторных сайтах catDE (A) и dhbA (B) (среднее ± стандартное отклонение; n = 3). Указаны достоверные различия между штаммами дикого типа и мутантными штаммами: ∗∗ P <0,01. Не наблюдалось значительного обогащения ДНК для gyrA , который служит отрицательным контролем.

CatDE участвует в метаболизме бациллибактина

Штамм B. subtilis дикого типа (168) и его производные обычно не синтезируют BB из-за нулевой мутации в гене sfp ( sfp 0 ), кодирующем фосфопантетеинилтрансфераза, необходимая для активации комплекса Dhb NRPS.Штаммы, лишенные функционального Sfp, секретируют смесь 2,3-дигидроксибензоата (DHBA) и его конъюгата с глицином (DHBG), вместе известного как DHB (G). Мы используем штамм sfp 0 и изогенный штамм с исправленным геном sfp ( sfp + ), который продуцирует BB для наших исследований гомеостаза железа.

Экспрессия catDE индуцируется в ~ 3 раза в штаммах sfp 0 и sfp + при истощении запасов железа под действием дипиридила (рис.3 и фиг. 6A-B), предполагая, что CatD и / или CatE могут участвовать в гомеостазе железа. Чтобы проверить эту идею, была оценена чувствительность к дипиридилу одиночных ( catD и catE ) и двойных ( catDE ) мутантных штаммов в sfp 0 и sfp + фонов с использованием диско-диффузионного анализа. . Действительно, как CatD, так и CatE играют важную роль во времена ограничения железа, поскольку рост мутантов сильнее подавлялся в присутствии дипиридила, хелатора железа (рис.5C-D). Поэтому мы предположили, что ферментативная активность CatDE может потребоваться для детоксикации производных BB катехоловых соединений, образующихся при ограничении содержания железа. Когда железо ограничено, BB секретируется в окружающую среду для приобретения железа, и комплекс Fe 3+ -BB импортируется обратно в клетку через систему FeuABC-YusV. Высвобождается железо, и BB расщепляется на мономеры BB (2,3-дигидроксибензоат-gly-thr) и, возможно, в дальнейшем перерабатывается в производные катехина, что может потребовать CatDE для детоксикации.

Рис. 5. catDE индуцируется при истощении запасов железа и играет важную роль в гомеостазе железа.

(A, B) Экспрессию catD контролировали в клетках дикого типа (A, sfp 0 ; B, sfp + ), выращенных в среде LB до (0 мин) и после обработки 100 мкМ дипиридил. Значительная разница между обработанными и необработанными группами обозначена как ∗∗ P <0,01.

(C, D) Чувствительность к дипиридилу WT, одиночных ( catD и catE ) и двойных ( catDE ) мутантных штаммов в обоих sfp 0 (C) и sfp + (D) фон оценивали с помощью диско-диффузионного анализа.Данные выражены как диаметр (среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n = 3) зоны ингибирования (мм). Указаны достоверные различия между штаммами дикого типа и мутантными штаммами: P <0,05 и ∗∗ P <0,01.

Мы использовали генетический подход для оценки участия CatDE в метаболизме BB. Мы использовали двойной мутант fur ymfD , в котором BB постоянно продуцируется и накапливается внутриклеточно из-за потери экспортера YmfD BB. Затем мы спросили, важен ли оперон catDE для роста в этих условиях.У четверного мутанта fur ymfD catDE по сравнению с двойным мутантом fur ymfD в первые 6 часов не было заметно дефектов роста, однако после этого у четверного мутанта наблюдался резкий лизис клеток, в то время как двойной мутант продолжал расти (рис. 6А). Мы пришли к выводу, что оперон catDE имеет решающее значение для поддержания жизнеспособности клеток, когда производные BB катехоловые соединения накапливаются внутриклеточно. Действительно, введение нулевой мутации dhbA в четверной мутант значительно спасло фенотип лизиса клеток (рис.6А).

Рис. 6. CatDE участвует в метаболизме ББ.

(A, B) Типичные кривые роста показаны для штаммов, которые постоянно продуцируют BB (мутация fur ) и накапливают BB внутриклеточно (из-за потери экспортера BB YmfD). Чтобы проверить, требуется ли CatDE для роста метаболизма BB дикого типа ( sfp + ) и его производных мутантных штаммов, наблюдали в среде LB в течение 25 часов. Эксперименты проводили трижды с тремя биологическими повторами каждый раз.

Рис. 7. Накопление внутриклеточного катехола, производного от ВВ, индуцирует экспрессию catD .

Уровни экспрессии мРНК catD оценивали на WT ( sfp + ) и его производных мутантах, выращенных в среде LB до OD 600 ~ 0,4. 23S рРНК использовали в качестве внутреннего контроля. Значимые различия обозначены как P <0,05 и ∗∗ P <0,01. NS обозначает не имеет значения.

Как только BB попадает обратно в цитозоль, он гидролизуется эстеразой BesA с высвобождением хелатированного железа, и сидерофор расщепляется на три мономера BB.Чтобы понять, вызван ли дефект лизиса клеток накоплением мономера BB или BB, мы ввели нулевую мутацию besA в четверной мутант ( fur ymfD catDE ). В отсутствие BesA дефект лизиса клеток больше не наблюдался, и клетки росли почти так же хорошо, как двойной мутант fur ymfD (фиг. 6B). Неизвестно, перерабатываются ли мономеры BB и каким образом. Тем не менее, мономер BB и, возможно, производные катехиновые соединения явно требуют CatDE для детоксикации.

Накопление внутриклеточного катехола, производного от BB, индуцирует экспрессию

catD

Поскольку внутриклеточные катехиновые соединения, производные от BB, могут поставить под угрозу приспособленность клеток, мы хотели определить, могут ли они также служить индукторами оперона catDE . Чтобы проверить это, мы сравнили уровни мРНК catD у двойного мутанта fur ymfD и одиночного мутанта fur . Действительно, экспрессия catD повышена у двойного мутанта (дефектного по оттоку BB) по сравнению с одиночным мутантом fur .Эта индукция обусловлена, в частности, накоплением внутриклеточных катехинов, производных BB, поскольку делеция dhbA или besA отменяет индукцию. Чтобы понять, какой регулятор отвечает за эту индукцию, мы отслеживали уровни мРНК catD у двойных мутантов fur catR и fur yodB . Когда отсутствовали и Fur, и CatR, индукция больше не была очевидной, что позволяет предположить, что YodB не реагирует на накапливающиеся катехолы. Напротив, когда отсутствовали и Fur, и YodB, наблюдался аналогичный уровень индукции.Эти результаты предполагают, что внутриклеточное накопление метаболитов катехолов, производных BB, может приводить по крайней мере к частичной инактивации репрессора CatR, тем самым приводя к индукции оперона catDE . Поскольку Fur и CatR совместно связывают in vivo , эта система настроена так, чтобы чутко реагировать на накопление катехоловых соединений (ощущаемое CatR) во время голодания по железу (ощущаемое Fur).

Занятость меха на участке оператора

catDE

Гены-мишени меха дерепрессируются в трех последовательных волнах при истощении запасов железа (3), что дает представление о различных ролях мишеней меха в метаболизме железа.Чтобы понять временную экспрессию гена catDE , мы отслеживали занятость Fur на этом участке оператора с помощью хромосомного FLAG-тегированного Fur как в WT, так и в P spac frvA . Используя ChIP-qPCR, мы обнаружили, что Fur быстро диссоциировал от сайта связывания ДНК и ~ 50% снижение занятости Fur наблюдалось в течение 3 минут после индукции FrvA (фиг. 8). Затем мы сравнили занятость Fur на этом сайте с таковой на трех целевых сайтах Fur, которые являются представителями трех наборов ранних, средних и поздних генов, определенных ранее (3).Результаты продемонстрировали, что занятость Fur на сайте оператора catDE следовала той же схеме, что и на сайте оператора позднего гена fsrA (рис. 8), предполагая, что экспрессия catDE индуцируется после дерепрессии биосинтеза BB. и BB-опосредованные системы захвата. Мы пришли к выводу, что дерепрессия catDE в Fur, вероятно, происходит вскоре после начала синтеза BB, и это приведет к начальному умеренному увеличению экспрессии catDE , что превентивно защитит клетки от последующего импорта BB или других катехолатных сидерофоров.Кроме того, из-за кооперативного взаимодействия Fur и CatR in vivo потеря репрессии Fur также сделает репрессор CatR более чувствительным к накоплению катехолов. Вместе потеря репрессии Fur и CatR сделает возможной эффективную детоксикацию производных сидерофоров катехоловых соединений.

Рис. 8. Занятость меха на площадках разных операторов.

Заполненность меха оценивалась с помощью ChIP-qPCR. Обогащение ДНК рассчитывали на основе введенной ДНК (1% от общей ДНК использовался для каждого эксперимента с ChIP).Заполненность мехом на разных участках в нулевой момент времени была установлена ​​на уровне 100%. Даты представлены как относительный процент (%) занятости в различные моменты времени после индукции FrvA 1 мМ IPTG (среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n = 3). Не наблюдалось значительного обогащения ДНК для gyrA , который использовали в качестве неспецифического отрицательного контроля.

Заключительные замечания

Здесь мы предоставили глобальный обзор потенциальных мишеней Fur-опосредованной регуляции генов путем картирования сайтов связывания Fur в условиях избыточного количества железа и после начала депривации железа.Наша работа подтверждает основной мех регулон, как определено ранее (9), и дополнительно предлагает несколько новых целей, заслуживающих дальнейшего изучения. К ним относятся потенциальные роли Fur в регуляции оперонов S477 ykoP и pps (синтез плипастина), а также в экспрессии FapR (регулятор синтеза жирных кислот), GidA (фермент, модифицирующий тРНК), CspB (белок холодового шока) и NarJ (нитратредуктаза). Здесь мы сосредоточили наше внимание на роли меха в регуляции catDE , кодирующего катехол-2,3-диоксигеназу.

Катехол-2,3-диоксигеназа — исключительно хорошо изученный фермент, известный своей центральной ролью в биоразложении широкого спектра ароматических соединений, образующих промежуточные катехоловые соединения. Здесь мы представляем новый пример эндогенно продуцируемого интоксиканта, разложение которого зависит от CatDE (рис. 9). После импорта бациллибактина железа в цитозоль эстераза BesA расщепляет трискатехолат сидерофор с высвобождением железа с образованием трех молекул мономера BB, 2,3-дигидроксибензоат-Gly-Thr.В отсутствие CatDE эта молекула или продукты ее дальнейшего разложения могут быть токсичными и запускать лизис клеток (рис. 9). Экспрессия CatDE находится под сложным контролем с участием трех совместно действующих репрессоров. Связывание Fur с регуляторной областью catDE , по-видимому, требует кооперативного взаимодействия (в основном с CatR). В начале депривации железа происходит начальная умеренная индукция catDE (как следует из эффекта мутации fur ), которая будет превентивно синтезировать CatDE.Поскольку катехоловые соединения накапливаются в клетке из-за импорта и обработки бациллибактина железа или импорта других катехолатных ксенозидерофоров, инактивация репрессора CatR приведет к полной индукции. Поскольку Fur и CatR связываются совместно, как только Fur высвобождается, репрессор CatR будет более легко инактивирован, что позволяет предположить, что система будет готова к быстрому ответу. Насколько нам известно, это первый пример эндогенного интоксиканта, который катаболизируется CatDE. Мы также представляем пример мишени Fur, которая зависит от кооперативного действия нескольких репрессорных белков.Это напоминает кооперативные взаимодействия, описанные ранее для Fur, NsrR и ResD, о которых сообщалось для клеток, растущих в анаэробных условиях (15).

Рис. 9. Корреляция между метаболизмом BB и детоксикацией катехолов

Эндогенный сидерофор BB синтезируется системой сборки NRPS (не-рибосомальная пептид-синтетаза) (DhbACEBF) (23) и секретируется главным фасилитатором-переносчиком суперсемейства YmfD, который находится под регуляция транскрипционного активатора Mta, регулятора семейства MerR системы переносчиков множественного лекарственного оттока (24).BB хелатирует железо с очень высоким сродством, и полученный комплекс трехвалентное железо-BB затем импортируется обратно в цитозоль через систему FeuABC-YusV и гидролизуется эстеразой BesA с высвобождением железа (25), что дает три BB-мономера (2,3 -дигидроксибензоат-Gly-Thr). До сих пор неизвестно, подвергается ли мономер ВВ дальнейшей переработке и каким образом. Тем не менее очевидно, что мономер BB и, возможно, производные катехоловых соединений BB требуют CatDE для детоксикации во время метаболизма.

Текст S1.Материалы и методы

Таблица S1. Штаммы и плазмиды, использованные в этом исследовании

Таблица S2. Праймерные олигонуклеотиды

Таблица S3. Известные меха-мишени, связанные с ChIP-пиками.

Таблица S4. Предполагаемые регулируемые Fur гены, связанные с ChIP-пиками

Таблица S5. Предполагаемые гены-мишени Fur, оцениваемые в этом исследовании

Рис. S1. предполагаемые участки связывания меха, особенно в условиях дефицита железа.

Предполагаемые сайты связывания апо-Fur, идентифицированные во внутригенных областях: (A) spo0B , (B) flhB , (C) xynP и (D) ylpC (также известный как fapR ). Две биологические копии были включены как Exp.1 и Exp.2 для каждого условия. S / N обозначает отношение сигнал / шум для пикового вызова.

Рис. S2. CatDE имеет решающее значение для разложения катехолов.

Чувствительность штаммов sfp 0 (A) и sfp + (B) к катехолу оценивали в минимальной среде Белицкого с использованием диско-диффузионного анализа.На каждый диск наносили 10 мкл 1 М катехола. Данные выражены как диаметр (среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n = 3) зоны ингибирования (мм). Указаны достоверные различия между штаммами дикого типа и мутантными штаммами: ∗∗ P <0,01.

Типичные кривые роста в минимальной среде Белицкого для штаммов sfp 0 (C) и sfp + (D). В обеих сериях экспериментов использовали 2 мМ катехола.

Рис. S3. Токсичность катехолов снижается в среде LB.

Типичные кривые роста нулевых мутантных штаммов WT и catD , выращенных в среде LB без или с добавлением 8 мМ катехола.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *