ПОТОКОСЦЕПЛЕНИЕ И ИНДУКТИВНОСТЬ КАТУШКИ —
Если через катушку проходит изменяющийся ток, то ее витки пересекаются переменным магнитным полем, вызываемым этим током, и на концах катушки возникает ЭДС индукции. Для количественной характеристики этого процесса вводятся понятия потокосцепления и индуктивности катушки. На рис .2.13 по-казана катушка с током, витки которой пронизывают различное число силовых линий, следовательно, магнитные потоки различных витков различны. Эти магнитные потоки называют потоками самоиндукции, а их сумму для всех витков катушки называют потокосцеплением самоиндукции (ψ).
Рис. 2.13 Рис. 2.14 Рис. 2.15.
В том случае, когда магнитная проницаемость среды постоянна, между потокосцеплением и создающим его током существует линейная зависимость
ΨL = L I (2.15)
где L – коэффициент пропорциональности называемый индуктивность ка- тушки. Единицей индуктивности является генри (Гн): На практике, как пра- вило, пользуются более мелкими единицами: миллигенри (1 мГн=10
микрогенри (1 мГн=10-6 Гн).
Индуктивность цилиндрической катушки, у которой длина достаточно велика
по сравнению с диаметром также может быть определена по формуле:
L = μ0 S w2/ l (2.16)
Так как eL = – dΨL /dt и ΨL = Li для катушки без ферромагнитного сердечника ( L=const) окончательно получим:
eL = -L di /dt (2.17)
ЭДС eL называют ЭДС самоиндукции, а рассмотренное явление возникно-вения ЭДС в катушке вследствие изменения тока в этой катушке – само индукцией. ЭДС самоиндукции, согласно принципу Ленца, препятствует изменению тока в катушке, поэтому ток достигает установившегося значе- ния постепенно. Для нахождения всей энергии, которая накопится в магнитном поле катушки за время dt при изменении тока от 0 до I, проинтегрируем выражение L di/dt и получим:
WL = L I2 / 2 (2.18)
В том случае, когда переменное магнитное поле созданное током одной катушки, пересекает витки, другой катушки (рис. 2.14), и наоборот, на зажимах последней катушки возникает ЭДС, которую называют ЭДС взаимоиндукции.
Магнитные потоки взаимоиндукции, пропорциональны токам, их созда- ющим, следовательно, и потокосцепление взаимоиндукции пропорциональны этим токам:
Ψ12 = M12 i1 , Ψ21 = M21 i2 (2.19)
Коэффициенты пропорциональности М\.ч и М2 называют взаимными индуктивностями. В том случае, когда катушки не содержат ферромаг-нитных сердечников, M12.= M21 i2 = M. Взаимная индуктивность M зависит от числа витков катушек, их размеров и взаимного расположения, а также
от магнитных свойств среды. Единица взаимной индуктивности M генри (Гн) При изменении потокосцепления взаимоиндукции первой катушки во второй катушке наводится ЭДС взаимоиндукции:
e12 = – dΨ12 /dt = -M di1 /dt (2.20)
Соответственно изменение потокосцепления взаимоиндукции второй катушки вызывает ЭДС взаимоиндукции в первой катушке
e2 1 = – dΨ2 1 /dt = -M di2 /dt (2.21)
Явление взаимоиндукции находит широкое применение в различных электро и радиотехнических устройствах. В частности, оно используется для транс- формации электроэнергии в целях переменного тока. Однако это явление может проявлять себя и как вредное. Например, в сердечнике катушки или трансформатора (рис.2.15) за счет явления взаимоиндукции возникает кольцевой ток, который называют вихревым. Протекание вихревых токов в сердечнике вызывает большие тепловые потери. Для уменьшения этих потерь ферромагнитные сердечники набирают из тонких изолированных друг от друга листов электротехнической стали с повышенным удельным электричес -ким сопротивлением.
1.1.2. Потокосцепления электрической машины
ности. Но для нулевой составляющей справедливо ia0 = ib0 = ic0 = i0 , поэтому, подставляя эти значения в (1.9), получим для фазы a статора
ψ1a0 = L1σi1a0 +lmi1a0 +lm cos2π/3 i1b0 +lm cos(−2π/3) i1c0 =i0 (L1σ +lm −lm / 2 −lm / 2)=i0L1σ
Очевидно, что аналогичные выкладки для потокосцеплений рассеяния обмоток фаз b и c приведут к такому же результату, т.е. ψ1a0 = ψ1b0 = ψ1c0 = L1σi0 . Та-
ким образом, потокосцепления составляющих нулевой последовательности для всех обмоток одинаковы и определяются индуктивностью рассеяния L1σ .
1.1.3. Уравнения статора и ротора в векторной форме
Уравнения Кирхгофа для фазных напряжений статора АД имею вид u1a = i1ar1 + dψdt1a ; u1b = i1br1 + ddtψ1b ; u1c = i1cr1 + ddtψ1c *
Перейдем к векторной форме записи, умножив второе уравнение на a , третье
на a2 , а затем складывая все три уравнения.
23 (u1a +u1ba +u1ca2 )= 23 (i1a +i1ba +i1ca2 )r1 + 23 dtd (ψ1a +ψ1ba +ψ1ca2 )
В результате мы получим уравнение в векторной форме
u | = i r + | dψ1 | (1.15) |
| |||
1 | 1 1 | dt |
|
|
|
|
Аналогичные преобразования можно выполнить в системе координат uv , вращающейся синхронно с ротором, и получить
u | = i r + | dψ2 | (1.16) | |
| ||||
2 | 2 | 2 | dt |
|
|
|
|
| |
Уравнения (1.15) и (1.16) записаны в разных системах координат. Для перевода уравнения (1.16) в неподвижную систему координат αβ умножим его на
оператор поворота e jϑ и представим потокосцепление ротора как ψ(2uv) = ψ(2αβ)e− jϑ
u2(uv)e jϑ = i2(uv)e jϑr2 + e jϑd (ψ(2αβ)e− jϑ )/ dt .
Опуская после преобразований индексы системы координат, получим
u2 | = i2r2 | + | dψ2 | − j | dϑ | ψ2 | = i2r2 | + | dψ2 | − jωψ2 | (1.17) |
dt | dt | dt |
где ω= dϑ/ dt – текущая частота вращения ротора.
Переход к неподвижной системе координат в уравнении ротора привел к разделению слагаемого, соответствующего ЭДС индукции, на две составляющие. Первая составляющая dψ2 / dt связана с изменением потокосцепления во времени
вследствие изменения во времени токов и называется ЭДС трансформации, по аналогии с процессом ее возбуждения в соответствующей электрической машине. Вторая – ωψ2 связана с изменением потокосцепления вследствие вращения рото-
Вычисление индуктивности распределённой обмотки
Главная >> Поддержка >> Словарь >>
Магнитные задачи в ELCUT решаются относительно вектороного магнитного потенциала А, связанного с индукций соотношением B =rotA. Для векторного потенциала справедливо следующее соотношение — если виток задан прямым и обратным проводом, то поток магнитного поля через этот виток вычисляется как Ψ2-1 = A
Для реальных проводников с неким сечением S вычисляется среднее значение векторного магнитного потенциала по сечению проводника
= 1/S * AdS.
Таким образом, для витка с током потокосцепление можно посчитать как Ψ2-1 = <A2> — <A1>.
В ELCUT интеграл <A> называется «потокосцепление на один виток». Такое название произошло потому, что интеграл равен потоку витка образованного данным проводником и проводником, находящимся на бесконечности, где А=0.
Пускай есть одиночный виток с током. В модели ELCUT этот виток представлен прямым и обратным проводом. Для вычисления индуктивности витка надо посчитать потокосцепление прямого провода , потокосцепление обратного провода , найти разницу Ψ
В случае если в обмотке есть несколько индуктивно не связанных витков, можно посчитать индуктивность каждого из них и сложить с учетом схемы соединения. L1 = Ψ1 / i1, L2 = Ψ2 / i1. | |
В случае если в обмотке есть несколько индуктивно идеально связанных витков, можно эти витки заменить одним и посчитать индуктивность этого эквивалентного витка. Надо посчитать потокосцепление прямого провода , потокосцепление обратного провода , найти разницу Ψ2-1 и поделить её на ток эквивалентного витка: L = Ψ2-1 / i. Индуктивность обмотки, содержащей n-последовательно соединенных витков будет в n2*L (в n2-раз больше чем у эквивалентного витка с током). | |
В случае если обмотка состоит из нескольких распределенных в пространстве витков, имеющих частичное перекрытие по потоку, следует учитывать взаимную индуктивность между витками: L = L Поток 1-го витка образован как собственным током витка, так и током другого витка: Ψ1 = L1*i1 + M12*i2. Итого для обмотки, когда i1=i2=i получим: Ψ = Ψ1 + Ψ2 — Ψ12 = L1*i + M12*i + L2*i + M12*i — М12*i = L1*i + L2*i + M12*i. Для вычисления потока Ψ в ELCUT надо вычислить интеграл «потокосцепление на один виток» для каждой из сторон витков и просуммировать согласно формуле Ψ = Ψ1 + Ψ2 — Ψ12 = b — а + b’ — а’ — (b — a’) = b’ — а. |
Опыт 7.7. Закон Фарадея. Потокосцепление — Электромагнитная индукция
Наглядно – интересно – просто – понятно! Данный курс представляет собой серию физических опытов и экспериментов. Демонстрацию физических явлений проводит незаурядный преподаватель, доцент кафедры общей физики НИЯУ «МИФИ» — Валериан Иванович Гервидс, глубокие знания и огромный преподавательский опыт которого делает курс «Физика в опытах. Электричество и магнетизм» уникальным. Курс состоит из девяти модулей по основным разделам: Электрическое поле, Проводники в электрическом поле, Энергия электрического поля, Постоянный электрический ток, Магнитное поле, Магнитное поле в веществе, Электромагнитная индукция, Квазистационарные токи, Электрический ток в газах. В его основе этого курса лежат 64 опыта, в которых объясняются различные физические явления. Зачем изучать этот курс? • Физика – наука экспериментальная. Лучше один раз увидеть, чем сто раз услышать или прочитать! • Именно эксперименты позволяют продемонстрировать и легко понять и простые, и сложные аспекты, которые традиционно преподаются в виде теоретического материала и математических моделей • Курс поможет Вам научиться использовать: o эксперимент как способ постановки вопроса, o эксперимент как инструмент изучения физического явления o эксперимент как форму ответа на вопрос • Очень часто достаточно «простые» физические вопросы имеют неожиданные ответы, которые зависят от конкретных условий проведения эксперимента. Демонстрация таких опытов и объяснение полученных в них результатов могут оказаться чрезвычайно интересными • Вы сможете увидеть применение изучаемых физических явлений в жизни, в технике и в быту • Изучая этот курс, вы восполните нехватку времени на экспериментальную, «живую» физику, которая ощущается в обычном учебном процесс Чему учит этот курс? • Пониманию широкого круга как простых, так и сложных физических явлений и процессов по тематике соответствующих разделов • Применению физических закономерностей для анализа различных физических явлений и процессов • Навыкам использования эксперимента • Базовым знаниям по физике будущих инженеров и специалистов в различных областях деятельности. Для кого этот курс? • Для тех, кто изучает физику, и хочет прояснить для себя различные вопросы (в школе, в вузе) • Для тех, кто преподает физику (в школе, в вузе) • Для тех, кто использует физику в своем рабочем процессе (инженеры, программисты и т.д.) • Для тех, кому это просто интересно
ПОТОКОСЦЕПЛЕНИЕ — Что такое ПОТОКОСЦЕПЛЕНИЕ?
Слово состоит из 15 букв: первая п, вторая о, третья т, четвёртая о, пятая к, шестая о, седьмая с, восьмая ц, девятая е, десятая п, одиннадцатая л, двенадцатая е, тринадцатая н, четырнадцатая и, последняя е,
Слово потокосцепление английскими буквами(транслитом) — potokostseplenie
Значения слова потокосцепление. Что такое потокосцепление?
Потокосцепление
Потокосцепле́ние (полный магнитный поток) — физическая величина, представляющая собой суммарный магнитный поток, сцепляющийся со всеми витками катушки индуктивности. Потокосцепление численно равно сумме магнитных потоков…
ru.wikipedia.org
Потокосцепление в электротехнике, полный магнитный поток (y), сцепленный с рассматриваемым контуром. По существу П. всегда совпадает с потоком в интегральном определении: F = =y, где В — вектор магнитной индукции, — поверхность…
БСЭ. — 1969—1978
ПОТОКОСЦЕПЛЕНИЕ — полный магнитный поток, пронизывающий электрический контур. Напр., потокосцепление многовитковой катушки индуктивности равно сумме потоков через все ее витки.
Большой энциклопедический словарь
Русский язык
Потокосцепле́ние, -я.
Орфографический словарь. — 2004
- потоках
- потоковый
- потоков
- потокосцепление
- поток
- потолкавшийся
- потолкаться
«Потокосцепление» морфологический разбор слова — ассоциации, падежи и склонение слов
Прилагательные к слову потокосцепление
Каким бывает потокосцепление? Предлагаем подбор прилагательных на основе литературных произведений и статей.
Данные, связанные с этим словом пока не обнаружены.
Глаголы к слову потокосцепление
Что может потокосцепление? Что можно сделать с потокосцеплением? Подбор подходящих глаголов на основе русского языка.
Данные, связанные с этим словом пока не обнаружены.
Ассоциации к слову потокосцепление
Подбор ассоциативного ряда. Слова, которые в той или иной степени ассоциируются с искомым.
Данные, связанные с этим словом пока не обнаружены.
Какого рода потокосцепление (морфологический разбор)
Разбор слова по части речи, роду, числу, одушевленности и падежу.
Часть речи:
существительное
Число:
единственное
Одушевленность:
неодушевленное
Падеж:
именительный
Склонение существительного потокосцепление (какой падеж)
Склонение слова по падежу в единственном и множественном числах.
| Падеж | Вопрос | Ед.число | Мн. число |
|---|---|---|---|
| Именительный | (кто, что?) | потокосцепление | потокосцепления |
| Родительный | (кого, чего?) | потокосцепления | потокосцеплений |
| Дательный | (кому, чему?) | потокосцеплению | потокосцеплениям |
| Винительный | (кого, что?) | потокосцепление | потокосцепления |
| Творительный | (кем, чем?) | потокосцеплением | потокосцеплениями |
| Предложный | (о ком, о чём?) | потокосцеплении | потокосцеплениях |
Сфера употребления
Телекоммуникации Общая лексика Электротехника Техника ФизикаНапишите свои варианты ассоциаций
РАЗНИЦА МЕЖДУ ПОТОКОМ И ПОТОКОСЦЕПЛЕНИЕМ | СРАВНИТЕ РАЗНИЦУ МЕЖДУ ПОХОЖИМИ ТЕРМИНАМИ — НАУКА
Flux v Flux Linkage Поток и потокосцепление — две очень важные концепции, обсуждаемые в теории электромагнетизма. Поток — это величина поля через определенную поверхность. Потоковая связь — это доля
Flux vs Flux Linkage
Поток и потокосцепление — две очень важные концепции, обсуждаемые в теории электромагнетизма. Поток — это величина поля через определенную поверхность. Потоковая связь — это доля исходящего потока от источника к захваченному потоку от стока. Обе эти идеи очень важны в таких областях, как электромагнитная промышленность, энергетика и электротехника, физика и многие другие области. Чтобы преуспеть в таких областях, необходимо полное понимание этих концепций. В этой статье мы собираемся обсудить, что такое поток и связь потоков, их определения, сходство потоков и связей потоков и, наконец, разницу между потоками и связями потоков.
Что такое Flux?
Flux — это концептуальное свойство. В таких полях, как электрическое, магнитное, электромагнитное и гравитационное поле, термин, называемый потоком, определяется для описания поля. Чтобы понять, что такое поток, нужно сначала понять силовые линии. Например, силовые линии магнитного поля или магнитные силовые линии представляют собой набор воображаемых линий, которые проводятся от N (северного) полюса магнита к S (южному) полюсу магнита. По определению, эти линии никогда не пересекают друг друга, если напряженность магнитного поля не равна нулю. Следует отметить, что магнитные силовые линии — это понятие. Их не существует в реальной жизни. Это модель, удобная для качественного сравнения магнитных полей. Для электрических полей линии проводятся от положительного конца к отрицательному. Говорят, что поток по поверхности пропорционален количеству силовых линий, перпендикулярных данной поверхности. Поток обозначается греческой буквой ψ. Концепция магнитного потока занимает особое место в электромагнитной индукции. При электромагнитной индукции ток, протекающий через замкнутый проводящий контур, пропорционален скорости изменения магнитного потока по замкнутой поверхности, который создается проводящим контуром.
Что такое Flux Linkage?
Потоковая связь — это свойство, которое очень важно при электромагнитной индукции. Представьте себе проводящий провод, образующий замкнутый контур. Проволока может быть любой формы. Флюсовая связь проволоки — это поток, проходящий через замкнутую поверхность, создаваемую границей проволоки. Предположим, что плотность потока магнитного поля равна B, а круглая катушка, имеющая N витков, расположена перпендикулярно магнитному полю. Магнитная связь катушки является произведением магнитной индукции, площади круга и количества витков. Электродвижущая сила, генерируемая внутри контура, пропорциональна скорости изменения потока через площадь или скорости изменения потокосцепления.
В чем разница между Flux и Flux Linkage? • Поток — очень важное понятие во всей электромагнитной теории, но потокосцепление важно только для электромагнитной индукции. • И потокосцепление, и флюс имеют одинаковые размеры. • Поток связи — это поток через определенную поверхность, тогда как поток описывает общее количество силовых линий. |
Clutch Masters: Automotive
| Цена: | 169 долларов.99 $ 169,99 + $ 30,38 перевозки |
- Убедитесь, что это подходит введя номер вашей модели.
- Экстремальные требования к производительности, предъявляемые к современным автомобилям, в сочетании с агрессивным сцеплением могут вызвать экстремальные ударные нагрузки на трансмиссию.
- Clutch Masters FCV-2000 (клапан управления потоком) помогает снизить ударные нагрузки, позволяя сцеплению немного проскальзывать во время включения.
- Универсальная установка
- Поставляется со шнурком MAPerformance.
Как конструкция соленоида влияет на цепи сцепления
Регулирование потока к муфтам так же важно, как и давление, которое прикладывает эти муфты.Это направление этой жидкости под давлением через различные клапаны, соленоиды и каналы, что обеспечивает правильное переключение передач в автоматической коробке передач. Без надлежащего потока жидкости невозможно получить или поддерживать адекватное давление, а сцепления не будут работать правильно, что приведет к множеству проблем с переключением передач, сгоревшим сцеплениям и возможным диагностическим неисправностям. Несмотря на то, что разнообразие этих клапанов, соленоидов и контуров, которые передают поток от насоса к сцеплениям, велико, есть некоторые основные функциональные сходства, которые могут помочь при попытке диагностировать проблемы переключения передач и отказы сцепления, связанные с гидравликой.
Линейные соленоиды
Линейные соленоиды — это соленоиды, которые используют электрическую энергию для линейного перемещения закрытого клапана на определенное расстояние. Движение этого клапана открывает и закрывает различные гидравлические контуры соленоида. Некоторые трансмиссии, в которых используются линейные соленоиды для помощи в управлении потоком к сцеплениям, — это 09G и U660E (, рис. 1, ). Однако методы, в которых используются эти линейные соленоиды, различны для каждой передачи.
| Рисунок 1: Клапан большего размера в U660E обеспечивает больший поток, чем соленоид TF-60SN (09G) C1. |
|---|
| |
В 09G (и 09D, TF-80, TF-81) используется отдельный линейный соленоид для каждой муфты (K1, K2, K3 и B1). Жидкость соленоидного модулятора проходит через соленоид для создания сигнального давления низкого расхода, которое затем направляется на отдельные регулирующие клапаны каждого сцепления. (Исключением является муфта B2, на которую давление в трубопроводе подается непосредственно от ручного клапана, когда выбран реверсивный ход.) Это модулированное сигнальное давление регулирует положение клапана управления муфтой, помогая контролировать скорость включения муфты (, рис. 2, ). .
| Рисунок 2: 09G C1 / K1 Цепь сцепления |
|---|
| |
Давление включения муфты передается через различные реле, переключатели и распределительные клапаны. При таком типе устройства износ электромагнитных клапанов модулятора снижает подачу соленоида, а износ линейных соленоидов приводит к потере управляющего давления. Поскольку регулирующие клапаны сцепления постоянно перемещаются и регулируют давление в ответ на воздействие соленоида, они, как известно, изнашивают литые отверстия.Износ в любой из этих областей приводит к потере давления жидкости, что вызывает проблемы с переключением передач и отказ сцепления. Известно, что втулки в этих соленоидах заедают при повышенной температуре, что приводит к очень грубому движению электромагнитного клапана, которое вызывает коды неисправности, проблемы с переключением и сгоревшие муфты.
| Рисунок 3: U660E C1 Цепь сцепления |
|---|
| |
Электромагнитные клапаны EDS / PWM
Эти соленоиды имеют широтно-импульсную модуляцию посредством рабочего цикла, задаваемого TCM. При срабатывании они обычно сбрасывают шар, который позволяет направлять модулированный малый поток к соответствующему клапану регулятора сцепления (, рис. 4, ).Затем клапаны регулятора сцепления направляют давление в трубопроводе через соответствующие контуры, чтобы задействовать сцепления. Некоторые современные трансмиссии с такими типами соленоидов и цепей — это ZF6HP19 / 21/26/28/32/34, 6T40 / 70 и 6F35 / 50 (, рис. 5, ). Отказ этих соленоидов не редкость, часто из-за проблем, связанных с мусором. Очистка экранов и внутренних частей может помочь. Поскольку эти соленоиды выдают переменное давление, клапаны, которые они приводят в действие, находятся в непрерывном движении. Таким образом, износ регулирующих клапанов сцепления и клапанов подъема или фиксации сцепления является обычным явлением и приводит к соответствующему сгоранию сцепления и / или проблемам с переключением, связанным со сцеплением.Давление подачи соленоида от электромагнитного модулятора или клапана ограничения подачи привода также имеет решающее значение для правильного переключения передач и работы сцепления, поэтому отверстие следует проверить на износ.
| Рисунок 4: Покомпонентное изображение соленоида 6T40 |
|---|
| |
| Рисунок 5: 6T40 (Gen.1), 1-2-3-4 (вперед) Цепь сцепления |
|---|
| |
| Рисунок 6: Число, выгравированное на соленоидном баллоне |
|---|
| |
| Рисунок 7 |
|---|
| |
Знание того, как конкретная трансмиссия, с которой вы работаете, управляет потоком к сцеплениям, может помочь вам решить, на какие клапаны и соленоиды обращать внимание при любых проблемах переключения передач или сцепления. Это также следует учитывать при определении того, как устранить износ или отказ различных компонентов в цепях. Большую часть этой информации можно найти, посмотрев на масляные контуры и проследив за цепью включения сцепления на клапаны и соленоиды, управляющие подачей.
MPS Гидравлический выключатель сцепления
Отпустите сцепление с кнопки. При активации гидравлический выключатель сцепления улавливает жидкость на стороне рабочего цилиндра агрегата. После деактивации жидкость проходит через регулятор потока для регулирования работы сцепления и затем попадает в главный цилиндр. На каждой стороне используется внутренняя резьба 1/8 NPT для облегчения установки в вашем приложении. Наши кнопки Pro доступны отдельно и являются идеальным дополнением к гидравлическому выключателю сцепления.Отлично подходит для добавления коробки задержки к велосипеду с гидравлическим сцеплением.
Номер детали | Описание | Гонщик Цена | |
|---|---|---|---|
1-0045 | Гидравлическое выключение сцепления MPS | 201 доллар США.90 | |
1-0047 | Только гидравлический клапан MPS | $ 152,90 | |
1-0046 | Клапан управления потоком MPS | 99 долларов.95 |
«Позвольте этому случиться» vs. «Сделать это случится» — The Mental Clutch
Меня всегда восхищали характеристики сцепления. Вы знаете, выступления, в которых усиливается давление, и спортсмен поднимается и доминирует, чтобы обеспечить желаемый результат? Я говорю об этих спектаклях. Хотя всем нравится смотреть на эти представления, они случаются не всегда.Часто, когда давление увеличивается, спортсмены напрягаются и не могут справиться с давлением, что мешает их выступлению, и они рушатся.
Производительность Cluth определяется как «Любое увеличение производительности или более высокая производительность, возникающая в условиях давления», (Otten, 2009, стр. 584). Было высказано предположение, что для того, чтобы результат был определен как сцепление , спортсмен должен осознавать давление и обладать способностью испытывать стресс, воспринимать результат как высокую важность и добиваться успеха в значительной степени благодаря интенсивным усилиям (Hibbs , 2010).
Поскольку моя консалтинговая компания называется The Mental Clutch, я постоянно читаю и ищу способы повысить шансы спортсмена на более эффективное выполнение сцепления. Одно исследование, в частности, с которым я познакомился в Журнале прикладной спортивной психологии, было озаглавлено «Психологические состояния, лежащие в основе отличных результатов в спорте: к интегрированной модели состояний потока и сцепления».
Итак, ЭТО — это исследование, которое я буду рад читать! Я чувствовал, что он зовет меня.
Для тех, кто не знаком с потоком, это хорошо изученный опыт спортивной психологии, который определяется как гармоничное и внутренне полезное состояние, характеризующееся интенсивным вниманием и поглощенностью определенной деятельностью, исключая ненужные мысли и эмоции. и ощущение того, что все соединяется или встает на свои места, даже в сложных ситуациях (Csikszentmihalyi, 2002). Короче говоря, поток — это состояние, в котором задача соответствует вашим способностям, и вы можете выполнить то, что необходимо, при этом чувствуя себя без усилий и время, стоящее на месте.
Спортивная психология много говорит о потоке, но достичь этого не так-то просто. Как спортсмены и тренеры, мы должны помнить, что во многих выступлениях дела идут не так, как надо. Вместо того, чтобы «позволить этому случиться» и попытаться пустить в ход, нам, возможно, придется углубиться в , чтобы «заставить это случиться» и обеспечить производительность сцепления.
В ходе исследования были обнаружены два психологических состояния во время отличного выступления. Один был описан как «позволяя этому случиться», , что соответствовало определению и описанию потока, где другое было «заставляя это происходить», , которое не соответствовало потоку.Заставить это случиться было иначе, так как описывалось как более трудоемкое и интенсивное при одновременном повышении чувства осознанности и концентрации.
Исследование было направлено на то, чтобы лучше понять процесс, посредством которого происходят характеристики потока и сцепления в спорте, а также предоставить практическое руководство для практикующих специалистов, стремящихся помочь спортсменам испытать состояние производительности.
Исследование показало, что в состоянии потока спортсмены сообщают, что они «находятся на автопилоте» и достигают личных рекордов, которые не могли быть лучше.Второе состояние — сцепление — описывалось спортсменами как «скрежетание» и «твердость». Было упомянуто, что это было нелегко или комфортно по сравнению с потоком.
Спортсмены также сообщили об использовании различных психологических навыков для достижения каждого состояния. Спортсмены сообщали о том, что они поддерживают свое состояние с помощью позитивных отвлекающих факторов, которые могут быть внутренними (погружение в мысли / пение песни) или внешними факторами (размышления о погоде). Элитные игроки в гольф также сообщали о том, что во время потоковых состояний концентрируют свою концентрацию на от на выполняемой задаче, разговаривая со своим кэдди между бросками.Часто, когда мы слишком много думаем о поставленной задаче , мы становимся гиперфокусированными и делаем ошибки или ошибки, поэтому отвлечение вашего ума и доверие своему телу делать работу может быть важным. Напротив, спортсмены, которые испытали сцепление, сообщили об использовании более ассоциативных стратегий, таких как постановка микро-целей и использование позитивного, мотивирующего разговора с самим собой. Эти стратегии помогли мобилизовать усилия, сосредоточить внимание и сохранить уверенность в себе. Следовательно, может случиться так, что состояния потока и сцепления также требуют различных стилей навыков саморегуляции.
Спортсменам, тренерам и другому вспомогательному персоналу важно учитывать каждое состояние и осознавать, что спортсмен может переключаться между ними во время выступления.
Это нашло отклик у меня, когда я размышлял о беге марафона. Я помню, что начало было тяжелым, и я очень нервничал, мне приходилось копать глубоко, чтобы не отставать от иноходца, чтобы достичь своей намеченной цели. Напоминание себе о том, почему я решил пробежать марафон, и все болезненные тренировочные пробежки, которые я делал перед началом, дали мне мотивацию, необходимую для того, чтобы надавить на задницу.Эта начальная часть определенно была государством сцепления. Примерно на полпути я помню, как мне казалось, что бег был естественным и легким, а мили пролетали незаметно. Я смог отвлечься от текущей задачи, завязав беседы с бегунами вокруг меня, наблюдая за лицами фанатов, мимо которых я проходил, и внимательно следя за происходящим со своим окружением. В то время я определенно был на плаву, так как моя уверенность возросла, и я был уверен, что смогу финишировать в этом марафоне. К концу последних 3 миль я начал чувствовать боль, вторгающуюся во все мое тело.Я был усталым, измученным и отчаянно хотел остановиться. Мне пришлось напомнить себе о своих целях и использовать мотивационный и обучающий разговор с самим собой, чтобы преодолеть последние изнурительные мили. Здесь мои мантры творили чудеса. Я написал на руке три мощных утверждения «Я есть» на тот случай, если они мне понадобятся. На протяжении нескольких миль я повторял себе: «Я силен, я конкурентоспособен, меня поддерживают». Это определенно снова состояние сцепления. Я смог финишировать, но это был очень болезненный опыт и потребовал больших усилий.
Я нашел это исследование освежающим и вдохновляющим. В мире спорта мы иногда думаем, что «либо есть, либо нет». Мы проповедуем важность поиска потока для достижения наших лучших результатов. Это исследование продемонстрировало, что нам не НУЖЕН поток для достижения наших целей. Да, поток — это отличное состояние, но добраться до него сложно, потому что чем больше мы пытаемся войти в поток, тем дальше от него мы становимся. Если поток — это не вариант, есть еще один способ завершить наше выступление, как задумано.Это когда производительность сцепления — лучший вариант. Это потребует больших усилий, может быть изнурительным и болезненным, но конечный результат того стоит!
Csikszentmihalyi, M. (2002). Поток: Психология оптимального опыта (2-е изд.). Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Харпер и Роу.
Хиббс, Д. (2010). Концептуальный анализ характеристик сцепления в соревновательных видах спорта. Журнал Философия спорта, 37 , 47-59.
Оттен, М. (2009). Эффективность удушения и сцепления: исследование спортивных результатов под давлением. Журнал прикладной спортивной психологии, 31 (5), 583-601.
Суонн К., Краст Л., Джекман П., Велла А. С., Аллен С. М. и Киган Р. (2017). Психологические состояния, лежащие в основе отличных результатов в спорте: к интегрированной модели состояний замедления и сцепления. Журнал прикладной спортивной психологии, 29, 375-401.
Поток генов поддерживает большую генетическую разницу в размере кладки в небольшом пространственном масштабе
Слаткин М.Поток генов в естественных популяциях. Annu. Rev. Ecol. Syst. 16 , 393–430 (1985)
Артикул Google ученый
Богонак, А. Дж. Распространение, поток генов и структура популяции. Q. Rev. Biol. 74 , 21–45 (1999)
CAS Статья Google ученый
Ленорман Т. Поток генов и пределы естественного отбора. Trends Ecol. Evol. 17 , 183–189 (2002)
Артикул Google ученый
Хендри, А. П., Дэй, Т. и Тейлор, Э. Б. Смешивание популяций и адаптивная дивергенция количественных признаков в дискретных популяциях: теоретическая основа для эмпирических тестов. Evolution 55 , 459–466 (2001)
CAS Статья Google ученый
Эберт, Д.и другие. Селективное преимущество перед генами иммигрантов в метапопуляции Daphnia . Наука 295 , 485–488 (2002)
ADS CAS Статья Google ученый
Keller, L. F. et al. Иммиграция и эфемерность естественного узкого места населения: данные молекулярных маркеров. Proc. R. Soc. Лондон. B 268 , 1387–1394 (2001)
CAS Статья Google ученый
Эрлих П.Р. и Рэйвен, П. Х. Дифференциация популяций. Наука 165 , 1228–1232 (1969)
ADS CAS Статья Google ученый
Кинг, Р. Б. и Лоусон, Р. Вариации окраски водных змей озера Эри: роль потока генов. Evolution 49 , 885–896 (1995)
Артикул Google ученый
Дхондт, А.A., Adriaensen, F., Matthysen, E. & Kempenaers, B. Неадаптивные размеры кладок у синиц. Природа 348 , 723–725 (1990)
ADS Статья Google ученый
Клобер, Дж., Перринс, К. М., Макклири, Р. Х. и Гослер, А. Г. Уровень выживаемости большой синицы Parus major в зависимости от пола, возраста и иммиграционного статуса. J. Anim. Ecol. 57 , 287–306 (1988)
Артикул Google ученый
Макклири, Р.H. & Clobert, J. в Population Biology of Passerine Birds (eds Blondel, J., Gosler, A. G. & Clobert, J.) 423–440 (Springer, Berlin, 1990)
Книга Google ученый
Марр, А. Б., Келлер, Л. Ф. и Арсез, П. Гетерозис и депрессия аутбридинга у потомков естественных иммигрантов в инбредную популяцию певчих воробьев ( Melospiza melodia ). Evolution 56 , 131–142 (2002)
Артикул Google ученый
Хендри, А.П., Тейлор, Э. Б. и Макфейл, Дж. Д. Адаптивная дивергенция и баланс между отбором и потоком генов: озерная и ручная колюшка в системе Misty. Evolution 56 , 1199–1216 (2002)
Артикул Google ученый
Stearns, S.C. & Sage, R.D. Неадаптация маргинальной популяции рыб-комаров, Gambusia affinis . Evolution 34 , 67–75 (1980)
Артикул Google ученый
Сторфер, А.& Сих, А. Генетический поток и неэффективное поведение против хищников у водной саламандры. Evolution 52 , 558–565 (1998)
Артикул Google ученый
Стэнтон, М. Л. и Гален, К. Жизнь на грани: адаптация против опосредованного окружающей средой потока генов у снежного лютика, Ranunculus adoneus . Am. Nat. 150 , 143–178 (1997)
Артикул Google ученый
Ламбрехтс, М.М. и Диас, П. С. Различия в начале яйцекладки между островными и континентальными средиземноморскими голубыми синицами Parus caeruleus —Фенотипическая пластичность или генетические различия. Ibis 135 , 451–455 (1993)
Артикул Google ученый
Kingsolver, J. G. et al. Сила фенотипического отбора в естественных популяциях. Am. Nat. 157 , 245–261 (2001)
CAS Статья Google ученый
Кребс, Дж.Р. и Дэвис, Н. Б. Поведенческая экология: эволюционный подход (Блэквелл, Оксфорд, 1991)
Google ученый
Гарант, Д., Круук, Л. Э. Б., Уилкин, Т. А., Макклири, Р. Х. и Шелдон, Б. С. Эволюция, обусловленная дифференцированным расселением в популяции диких птиц. Nature doi: 10.1038 / nature03051 (this issue)
Verhulst, S. & Van Eck, H.M. Поток генов и скорость иммиграции среди островной популяции больших синиц. J. Evol. Биол. 9 , 771–782 (1996)
Артикул Google ученый
Ван Нордвейк, А. Дж., Ван Бален, Дж. Х. и Шарлоо, У. Генетические и экологические вариации размера кладки большой синицы ( Parus major ). Neth. J. Zool. 31 , 342–372 (1981)
Google ученый
Ван Тиендерен, П.Х. и Ван Нордвейк, А. Дж. Распространение, родство и инбридинг в островной популяции большой синицы. J. Evol. Биол. 1 , 117–137 (1988)
Артикул Google ученый
Куинн, Г. П. и Кео, М. Дж. Планирование экспериментов и анализ данных для биологов (Cambridge Univ. Press, Кембридж, 2002)
Книга Google ученый
SAS Institute Inc., Руководство пользователя SAS / STAT (SAS Institute Inc., Северная Каролина, 1996)
Google ученый
Арнольд, С. Дж. И Уэйд, М. Дж. Об измерении естественного и полового отбора: Теория. Evolution 38 , 709–719 (1984)
Артикул Google ученый
Круук, Л. Э. Б. Оценка генетических параметров в естественных популяциях с использованием «животной модели». Phil. Пер. R. Soc. Лондон. B 359 , 873–890 (2004)
Артикул Google ученый
Линч, М. и Уолш, Б. Генетика и анализ количественных признаков (Sinauer Associates, Массачусетс, 1998)
Google ученый
Neumaier, A. & Groeneveld, E. Ограниченная оценка максимального правдоподобия ковариаций в разреженных линейных моделях. Genet. Sel. Evol. 30 , 3–26 (1998)
Артикул Google ученый
Groeneveld, E., Kovac, M., Wang, T. L. и Fernando, R. L. Вычислительные алгоритмы в универсальном пакете BLUP для многомерного прогнозирования и оценки. Arch. Anim. Порода. 35 , 399–412 (1992)
Google ученый
Молекулярное сцепление между потоком актина и адгезиями N-кадгерина управляет миграцией конуса роста
Abstract
Молекула адгезии N-кадгерин играет важную роль в развитии нервной системы, в частности, стимулируя отрастание аксонов, но молекулярные механизмы, лежащие в основе этого эффекта, в основном неизвестны.Одна возможность, так называемая модель «молекулярного сцепления», может включать прямую механическую связь между адгезией N-кадгерина на мембране и основанной на актине внутриклеточной подвижностью в конусах роста нейронов. Используя живую визуализацию первичных нейронов гиппокампа крысы, помещенных на субстраты, покрытые N-кадгерином, и оптический захват микросфер, покрытых N-кадгерином, мы демонстрируем здесь сильную корреляцию между скоростью конуса роста и механической связью между связанными с лигандом рецепторами N-кадгерина и ретроградный поток актина.Эта взаимосвязь поддерживается за счет варьирования плотности лиганда и экспрессии мутировавших рецепторов N-кадгерина или небольших интерферирующих РНК для нарушения связывания с катенинами. Удерживая движение микросфер с помощью оптического пинцета или микроиглы, мы дополнительно демонстрируем проскальзывание связей кадгерин-цитоскелет при низких силах, а при более высоких силах — локальное накопление актина, которое усиливает возникающие контакты N-кадгерина. Вместе эти данные подтверждают прямую передачу основанных на актине сил тяги на N-кадгериновые адгезии через партнеров катенинов, управляя продвижением конуса роста и расширением нейритов.
Ключевые слова: удлинение аксонов , слитый белок N-кадгерин-Fc, катенины, оптический пинцет, отслеживание отдельных частиц, микроманипуляция развитие и восстановление нервной системы. Подвижность конуса роста зависит от динамической регуляции актиновой сети с полимеризацией, происходящей на переднем крае, деполимеризацией в центральной области и активностью миозинов, притягивающих ламеллиподные актиновые филаменты (Lin et al., 1996; Маллаварапу и Митчисон, 1999; Дифенбах и др., 2002). В целом это приводит к непрерывному ретроградному потоку актина.
Ростовые конусы прикрепляются к внеклеточному матриксу и соседним клеткам через специфические рецепторы адгезии, то есть интегрины, молекулы адгезии клеток Ig (IgCAM) и кадгерины. Важный вопрос заключается в том, как прогрессирование конуса роста на адгезивных субстратах связано с подвижностью актина. Преобладающая гипотеза, механизм «молекулярного сцепления», заключается в том, что механическое соединение между связанными с лигандом адгезионными рецепторами и потоком актина позволяет передавать тяговые силы на субстрат, что приводит к локальному уменьшению ретроградного потока и его продвижению вперед (Mitchison and Киршнер, 1988; Сутер и Форшер, 1998).В случае конусов роста Aplysia , взаимодействующих через ApCAM [гомолог молекулы адгезии нервных клеток позвоночных (NCAM)], такое соединение субстрат-цитоскелет действительно сопровождается выступом богатого микротрубочками центрального домена в сторону жестких контактов и продвижение вперед богатый актином ламеллиподиум (Lin and Forscher, 1995; Suter et al., 1998). Однако взаимосвязь между фактическим перемещением конусов роста, приводящим к удлинению аксонов, и степенью сцепления рецепторов с потоком актина не была продемонстрирована.
Рецептор адгезии N-кадгерин (Ncad) играет роль во множестве процессов в ЦНС позвоночных, включая позиционирование клеток (Kadowaki et al., 2007), отрастание аксонов (Riehl et al., 1996), фасцикуляцию и ветвление дендритов (Yu, Malenka, 2003; Bekirov et al., 2007), синаптогенез (Benson, Tanaka, 1998) и синаптическая пластичность (Bozdagi et al., 2000; Togashi et al., 2002; Okamura et al., 2004). ). Эффект N-кадгерина в стимулировании роста аксонов можно имитировать на моделях клеточных культур (Matsunaga et al., 1988; Lemmon et al., 1992; Саффелл и др., 1997; Kamiguchi and Yoshihara, 2001), но лежащие в основе молекулярные механизмы остаются неясными. В частности, существует ли процесс сцепления для опосредованной N-cadherin локомоции ростового конуса и каких молекулярных партнеров он может вовлекать, все еще неизвестно. Здесь, используя первичные нейроны, взаимодействующие с субстратами, покрытыми N-кадгерином, вместе с визуализацией в реальном времени и оптическими манипуляциями, мы показываем, что механическое соединение между рецепторами N-кадгерина и потоком актина через катенины является основным детерминантом подвижности конуса роста и расширения нейритов.
Результаты
N-кадгерин избирательно стимулирует расширение нейритов и миграцию конусов роста
Мы впервые разработали экспериментальную систему, поддерживающую рост нейритов, специфичный для N-кадгерина. Мы использовали эмбриональные нейроны гиппокампа крысы, помещенные на покровные стекла, покрытые очищенным N-кадгерином-Fc. Ncad-Fc индуцировал более развитую нейритную сеть по сравнению с субстратами, покрытыми другими белками адгезии cad11-Fc или SynCAM-Fc, или только Fc ( A ). Этот нейритогенный эффект N-кадгерина был подобен тому, о котором сообщалось ранее для других нейронов (Lemmon et al., 1992; Саффелл и др., 1997; Камигучи и Йошихара, 2001). Число нейритов на клетку (данные не показаны) и длина самого длинного нейрита, наиболее вероятно, аксона, увеличивались с увеличением плотности покрытия Ncad-Fc ( D ). Мы также охарактеризовали локомоцию конуса роста с помощью покадровой микроскопии ( B ; дополнительные видео 1, 2, доступные на www.jneurosci.org в качестве дополнительных материалов). Смещение центроидов конуса роста увеличивалось равномерно с течением времени, без пауз, что позволяло рассчитать долгосрочную скорость ( C ).Скорость конуса роста увеличивалась с увеличением плотности покрытия Ncad-Fc и резко коррелировала с длиной нейрита ( D ), указывая на то, что нейритогенный эффект N-кадгерина обусловлен стимуляцией миграции конуса роста. Линейная взаимосвязь согласуется с концепцией, что ростовые конусы удлиняют нейриты, притягивая их, скорость конусов роста переводится в постоянную скорость расширения нейритов (Lamoureux et al., 2002). Эти эффекты были специфичными для адгезии N-кадгерина, поскольку добавление хелатора кальция EGTA или антитела GC4 для блокирования гомофильного связывания N-кадгерина резко снижало продвижение конуса роста и удлинение нейритов ( D ).
Влияние плотности Ncad-Fc на длину нейритов и скорость конуса роста. Первичные нейроны помещали на покровные стекла, покрытые различными разведениями Ncad-Fc, cad11-Fc, synCAM-Fc или Fc, и наблюдали через 2 дня. A , Изображения для субстратов Ncad-Fc и synCAM-Fc (плотность покрытия, 1 мкг / см 2 ), где очерчен самый длинный нейрит. B , Покадровые изображения конусов роста, движущихся на подложках Ncad-Fc или Fc. Мы специально выбрали конусы роста из самых длинных нейритов. C , Положение отдельных центроидов конуса роста отслеживалось, и их смещение было нанесено на график во времени. D , Корреляция между скоростью конуса роста и длиной самого длинного нейрита, включая все условия. Среднюю длину нейритов рассчитывали по 10–54 клеткам, а среднюю скорость — по 11–64 отдельным конусам роста на одно условие. SynCAM и Cad-11 (светлые кружки) не учитываются при корреляции.
Закрепление N-кадгерина в потоке актина коррелирует со скоростью конуса роста
Затем мы охарактеризовали физическую связь между N-кадгерином и основным потоком актина, используя микросферы, покрытые Ncad-Fc, манипулируемые оптическим пинцетом. Нейроны помещали на полилизин, чтобы избежать мобилизации эндогенных рецепторов N-кадгерина на базальной поверхности. Микросферы помещали на ростовые конусы на 2 с, затем либо оптическую ловушку освобождали и траектории шариков отслеживали в течение 2 мин, либо ловушку применяли непрерывно и количественно определяли задержку выхода шариков (вверху).Сто процентов шариков, покрытых плотностью 1 мкг / см 2 Ncad-Fc, оставались прикрепленными к дорсальной поверхности конуса роста ( n, = 40), и эта фракция снижалась до 32% в присутствии EGTA ( n = 26) или 12% с использованием блокирующих функцию антител к N-кадгерину ( n = 24), что указывает на специфичность адгезии. Микросферы, покрытые высокой плотностью Ncad-Fc (0,3 и 1 мкг / см 2 ), демонстрировали направленное ретроградное движение с минимальной боковой диффузией ( A ; дополнительное видео 3, доступно на www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала) и мог покинуть оптическую ловушку за несколько секунд ( D ). При промежуточных плотностях Ncad-Fc (0,1 и 0,03 мкг / см 2 ) траектории шариков были более нерегулярными и характеризовались более высокой степенью латеральной подвижности ( B ). Гранулы также показали более длительный латентный период перед выходом из ловушки ( E ). Микросферы, покрытые минимальной плотностью Ncad-Fc (0,01 мкг / см, 2 ) или одним Fc, плохо прилипали и демонстрировали по существу броуновское движение ( C ; дополнительное видео 4, доступно на www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала). Они также оставались в течение нескольких минут в постоянно применяемой ловушке ( F ) и могли легко перемещаться по нейронной поверхности (данные не показаны). Для каждой траектории среднеквадратичное смещение во времени ( т ) было подобрано уравнением диффузии / потока 4 Dt + V 2 t 2 ( G ), где D и V, представляют коэффициент диффузии и обратную скорость шарика соответственно (Kucik et al., 1991). Скорость шариков, покрытых Ncad-Fc (~ 5 мкм / мин), близкая к ретроградной скорости флуоресцентно меченного актина, измеренной в нейронах DRG (Diefenbach et al., 2002), не зависела от концентрации Ncad-Fc и резко снижалась за счет добавление цитохалазина D, который отменяет динамику актина (). Таким образом, параметр V , вероятно, отражает реальную скорость ретроградного потока актина. Напротив, коэффициент диффузии D уменьшался по мере увеличения плотности Ncad-Fc, отражая более высокое связывание ().Мы также измерили долю гранул, покидающих ловушку за 1 мин ( P e ), которая плавно увеличивалась с концентрацией Ncad-Fc и падала до нуля в присутствии цитохалазина D ().
Взаимосвязь между закреплением рецептора и цитоскелета и скоростью конуса роста. A – F , латексные микросферы (1 мкм), покрытые высокой плотностью Ncad-Fc ( A , D ), средняя плотность Ncad-Fc ( B , E ) или только Fc ( C , F ) либо помещали на 2 с на периферию конусов роста с помощью оптического пинцета, а затем оставляли в покое на 2 минуты (верхняя левая диаграмма, A). –C ) или сдерживается постоянным применением оптической ловушки (верхняя правая диаграмма, D – F ). A – C , Бусинки показаны в момент времени 0, а красные кривые представляют 2-минутные траектории. D – F , Пунктирными линиями обозначено положение ловушки и указано время после первого контакта. G , Среднеквадратичное смещение от каждой траектории было построено во времени ( t ) и аппроксимировано уравнением 4 Dt + V 2 t 2 , где D и V — коэффициент диффузии и средняя скорость шарика соответственно (показаны 3 отдельных примера).χ 2 значений, полученных с помощью этого двухпараметрического уравнения, были существенно ниже, чем для однокомпонентного уравнения, что указывает на лучшее соответствие (например, для промежуточного покрытия Ncad-Fc χ 2 = 0,06 для двойного компонента, χ 2 = 2,1 только для потока и χ 2 = 3,3 только для диффузии). H , Корреляция между индексом сцепления и скоростью конуса роста для различных разведений Ncad-Fc. Средний индекс сцепления был рассчитан для всего 10–38 отдельных шариков на одно условие.
Таблица 1.
Параметры, характеризующие движение микросфер в зависимости от плотности покрытия N-кадгерина
| Ncad-Fc (мкг / см 2 ) | 0 (Fc) | 0,01 | 0,03 | 0,1 | 0,3 | 1 | 0,3 + CytD |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| D (10 −2 мкм 2 / с) | 3,3 ± 0,7 | 1,6 ± 0,3 * | ± 0,3 *1.2 ± 0,2 ** | 0,9 ± 0,1 ** | 0,9 ± 0,1 ** | 1,5 ± 0,7 * | |
| V (мкм / мин) | 1,9 ± 0,5 | 4,5 ± 0,7 * | 4,8 ± 0,7 * | 5,0 ± 0,3 ** | 5,1 ± 0,3 ** | 4,8 ± 0,4 ** | 0,06 ± 0,05 * ** |
| P e (%) | 18% | 29% | 35% | 47% | 84% | 100% | 0% | 10; 11 | 23; 14 | 17; 34 | 22; 43 | 26; 30 | 18; 9 | 9; 9 |
Мы объединили эффекты на диффузию шариков, скорость и уход в один надежный параметр, называемый индексом связи, который определен как P e V log ( D 0 / D ) (в микрометрах в минуту).Логарифмическая функция проистекает из того факта, что коэффициент диффузии мембранных белков часто охватывает несколько порядков величины (Kucik et al., 1999; Thoumine et al., 2005) и использует эталонный коэффициент диффузии D 0 , т.е. получено для гранул, покрытых Fc (0,03 мкм 2 / с). После проверки с помощью иммунофлуоресценции того, что количество Ncad-Fc, адсорбированного на микросферах и покровных стеклах, увеличивалось аналогично концентрации покрытия (дополнительный рисунок 1, доступный на www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала), мы построили график зависимости индекса связи от скорости конуса роста ( H ). Мы наблюдали резкую корреляцию, демонстрируя, что степень прикрепления рецептора N-кадгерина к ретроградному потоку актина является хорошим предиктором продвижения конуса роста. Эффект был специфическим для N-кадгерина, потому что два других лиганда, кадгерин-11 и SynCAM, выходили далеко за пределы линии корреляции ( H ).
Проскальзывание связей между рецепторами N-кадгерина и потоком актина при малых силах
Тот факт, что даже при максимальной плотности покрытия Ncad-Fc скорость роста конусов (~ 1 мкм / мин) остается намного меньше, чем скорость поток актина (5 мкм / мин) подразумевает некоторое проскальзывание между движущейся сетью актина и рецепторами N-кадгерина, участвующими в адгезивных взаимодействиях на базальной поверхности.Чтобы исследовать этот процесс, мы более внимательно изучили поведение шариков, покрытых средой плотностью Ncad-Fc (0,03 и 0,1 мкг / см 2 ), поддерживаемых на конусах роста с непрерывно применяемой оптической ловушкой. Мы наблюдали множество случаев разрушения, при которых шарики начинали двигаться назад на 0,3–0,6 мкм, а затем иногда защелкивались обратно в центр ловушки за <200 мс ( A , B ; дополнительное видео 5, доступно на www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала). Шестьдесят восемь таких событий были зарегистрированы из 282 протестированных бусин (частота разрушения 0.24). Частота повторных захватов резко увеличивалась в присутствии цитохалазина D (7 событий из 9 гранул; частота 0,77) по сравнению с контрольным условием DMSO (2 события из 10 гранул; частота 0,20 аналогична необработанным клеткам), что указывает на то, что это явление отражает временную связь с актиновой сетью. Умножив расстояние, пройденное от центра ловушки на ее жесткость, мы вычислили соответствующие силы разрушения, в среднем 1,6 ± 0,1 пН ( n = 68).Гистограмма показала основной пик с центром при 1,2 пН вместе с меньшими вторичными пиками при 2,5 и 4 пН ( C ), что подтверждает мнение о том, что повторный захват шарика соответствует разрыву отдельных или очень небольшого числа молекулярных связей. Обратите внимание, что 1 мкг / см 2 гранул Ncad-Fc легко ускользают ( B ), потому что оптическая ловушка недостаточно сильна по сравнению с силами, создаваемыми потоком актина. Позже мы покажем анализ с использованием микроиглы, в котором мы действительно можем ограничить микросферы и продемонстрировать проскальзывание при высокой плотности покрытия Ncad-Fc.
События разрушения, отображаемые оптически ограниченными микросферами, покрытыми N-кадгерином. A , Микросфера, покрытая 0,1 мкг / см 2 Ncad-Fc начинает ускользать через 50 с после первоначального контакта, а затем быстро возвращается в центр ловушки. Пунктирная линия указывает положение равновесия захвата. B , Соответствующий график, показывающий расстояние, пройденное бортом относительно центра ловушки, в зависимости от времени. В этом примере были идентифицированы два события обрыва (стрелки) (темно-серый след).Окончательный уход выглядит как внезапное линейное увеличение смещения с течением времени. Гранулы, покрытые 1 мкг / см 2 Ncad-Fc, быстро ускользают (черный след), тогда как гранулы, покрытые одним только Fc, остаются в ловушке неопределенное время (нижний серый след). Для ясности, следы 1 мкг / см 2 Ncad-Fc и Fc сдвинуты вверх и вниз на 0,5 мкм соответственно. C , Гистограмма силы всех аварийных событий.
Возмущающие взаимодействия между рецепторами N-кадгерина и катенинами аналогичным образом влияют на рост нейритов и рецептор-цитоскелетное соединение
Для исследования молекулярных детерминант, лежащих в основе закрепления N-кадгерина в потоке актина, мы сначала использовали подход, основанный на экспрессии мутировавших Рецепторы N-кадгерина.Нейроны трансфицировали либо NcadΔextra (Riehl et al., 1996), NcadΔβcat (Thoumine et al., 2006), NcadAAA (Chen et al., 2003), NcadWT или GFP в качестве контроля. Ранее мы показали, что эти рецепторы экспрессируются примерно вдвое по сравнению с эндогенным N-кадгерином и правильно адресованы на поверхность нейронов (Thoumine et al., 2006). Сначала мы охарактеризовали влияние этих конструкций на удлинение нейритов для нейронов, нанесенных на Ncad-Fc, и проверили их специфичность, сравнивая с клетками, выращенными на ламинине.Трансфекция NcadWT привела к небольшому (18%), но не значительному уменьшению длины нейритов по сравнению с GFP-положительными клетками, эффект, который также был обнаружен для клеток, нанесенных на ламинин (). Напротив, нейроны, экспрессирующие NcadΔextra, NcadΔβcat и NcadAAA, все имели значительно более короткие нейриты по сравнению с состоянием GFP, со средним сокращением длины на 50, 30 и 45% соответственно (). Воздействие этих мутантов на рост нейритов иногда было настолько сильным, что нейроны, по-видимому, оставались в довольно неполяризованной стадии с небольшой дифференцировкой аксон-дендрит (Bradke and Dotti, 1997; Lamoureux et al., 2002). Действие NcadΔextra было высокоспецифичным для Ncad-Fc, поскольку его экспрессия не влияла на рост аксонов на ламинине ( B ). Однако эффекты NcadΔβcat и NcadAAA были менее избирательными, поскольку их экспрессия также снижала распространение нейритов на ламинине на ~ 30%. Есть несколько возможных объяснений такого поведения, которые будут рассмотрены в ходе обсуждения.
Влияние мутировавших рецепторов N-кадгерина на рост нейритов. Нейроны помещали на покровные стекла, покрытые 0.3 мкг / см 2 Ncad-Fc или 5 мкг / см 2 ламинин, трансфицированный на 1 DIV с помощью GFP, Ncad-GFP, GFP + NcadΔextra, NcadΔβcat-GFP или NcadAAA-YFP и наблюдаемый на 2 DIV. A , Репрезентативные изображения флуоресценции GFP для рецепторов, меченных GFP, и иммуноокрашивание против myc tag для Ncad-Δextra. B . Длина самого длинного нейрита нанесена на график для каждой трансфекции. Средние значения длины, полученные для мутантов N-кадгерина, сравнивают с помощью ANOVA с контрольной трансфекцией GFP в каждом субстратном состоянии.* p <0,05; ** p <0,01. Планки погрешностей указывают на SEM.
Затем связь мутировавших рецепторов N-кадгерина с потоком актина оценивалась с помощью оптического пинцета (). Скорость обратного движения шариков Ncad-Fc, помещенных на клетки, трансфицированные GFP или NcadWT, была немного снижена по сравнению с нетрансфицированными аналогами (сравните), что указывает на то, что поток актина был нарушен самим протоколом трансфекции. Однако, учитывая значительное проскальзывание, этой скорости все еще было достаточно, чтобы обеспечить продвижение конуса роста с нормальной скоростью, что привело к нормальной длине нейрита для GFP-экспрессирующих клеток (∼200 мкм для плотности покрытия Ncad-Fc, равной 0.3 мкг / см 2 ) (сравните D , B ). Кроме того, гранулы, покрытые Ncad-Fc, быстро связываются с потоком актина в нейронах, трансфицированных GFP или NcadWT, даже в присутствии непрерывной ловушки ( A , B ), что приводит к высокой вероятности ускользания ( C ) и индекс связывания ( D ), и демонстрирующий прикрепление интактного N-кадгерина к актину. Что касается влияния на длину нейритов, наблюдалось небольшое и незначительное снижение индекса сцепления для NcadWT, что можно объяснить более высокой адгезией (см. Ниже Слабая корреляция между силой связывания N-кадгерина и миграцией конуса роста и Обсуждение).Напротив, гранулы Ncad-Fc на клетках, трансфицированных NcadΔextra, NcadΔβcat и NcadAAA, показали более трудный уход по сравнению с аналогами, экспрессирующими GFP ( A – C ). Вместе с уменьшенной скоростью шариков и повышенным коэффициентом диффузии () это привело к значительно более низкому индексу сцепления для мутантов N-кадгерина по сравнению с условиями GFP и NcadWT ( D ). Хотя здесь снова эффекты NcadAAA и NcadΔβcat могут влиять на поток актина неспецифическим образом (см. Обсуждение), индекс сцепления в целом сильно коррелировал с длиной аксона в этих условиях нарушения взаимодействий кадгерин-катенин ( D ).
Влияние мутировавших рецепторов N-кадгерина на сцепление рецептор-цитоскелет. Нейроны, культивированные на полилизине, трансфицировали при 1 DIV каждой из пяти плазмид. На 2 DIV микросферы, покрытые 0,3 мкг / см 2 Ncad-Fc, выдерживали на ростовых конусах в течение 2 минут, непрерывно применяя оптический пинцет. A , Типичные изображения DIC и соответствующие изображения флуоресценции белков, меченных GFP (вставки), представлены для каждого состояния. Непомеченный NcadΔextra котрансфицировали GFP в соотношении 4: 1, и мы проверили ретроспективным иммуноокрашиванием, что все GFP-положительные нейроны также экспрессируют NcadΔextra.Бусинки показаны в момент времени 0, а траектории, усеченные через 1 минуту, показаны красным. B , Соответствующие перемещения в зависимости от времени. C , Фракция шариков, выходящих из ловушки за <1 мин. D , Индекс сцепления в зависимости от длины нейрита для всех трансфекций. * p <0,05; ** p <0,01.
Таблица 2.
Параметры, характеризующие движение микросфер для различных мутантов N-кадгерина
| Трансфекция | GFP | NcadWT | NcadΔextra | NcadΔβcat | −2 мкм 2 / с) | 0.5 ± 0,1 | 0,8 ± 0,1 | 0,8 ± 0,3 | 0,7 ± 0,1 | 0,7 ± 0,3 |
|---|---|---|---|---|---|
| В (мкм / мин) | 3,2 ± 0,2 | 3,1 ± 0,4 | 1,5 ± 0,4 ** | 2,4 ± 0,2 | 1,8 ± 0,3 * |
| n | 59 | 52 | 16 | 33 | 26 |
На молекулярном интерфейсе между рецепторами N-кадгерина и потоком актина мы использовали другую стратегию, основанную на интерференции РНК против α-катенина.Поскольку основной изоформой α-катенина в культивируемых нейронах гиппокампа является αE-катенин (дополнительный рисунок 2 A , доступен на сайте www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала), мы специально разработали и протестировали миРНК против αE-катенина вместе с контролем. миРНК. Трансфекция этих миРНК в гетерологичные клетки (дополнительный рисунок 2 B , C , доступен на www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала) или нейроны ( A , дополнительный рисунок 2 D , доступен на www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала) показал резкое подавление экспрессии αE-катенина по сравнению с контрольными трансфицированными клетками (~ 50%, измеренные иммуноблоттингом). Нейроны с РНКи против αE-катенина росли значительно короче нейритов на субстратах, покрытых Ncad-Fc, чем нейроны, трансфицированные контрольной миРНК ( A , B ). Этот эффект был специфическим для адгезивного взаимодействия N-кадгерина, поскольку не наблюдалось значительной разницы, когда клетки высевали на субстраты, покрытые полилизином ( B ).РНКи αE-катенина также препятствовали способности покрытых Ncad-Fc шариков, помещенных на ростовые конусы, выходить из оптической ловушки ( C , D ). Действительно, вероятность ускользания была снижена на 60% по сравнению с контрольной РНК ( E ). Таким образом, специфическое снижение экспрессии белка α-катенина снижает как удлинение нейритов, так и эффективность связывания, что убедительно свидетельствует о том, что αE-катенин является ключевой молекулой в связи между адгезией N-кадгерина и ретроградным потоком актина.
Влияние сайленсинга α-катенина на рост нейритов и сцепление N-кадгерин-цитоскелет. Нейроны помещали на покровные стекла, покрытые 0,3 мкг / см 2 Ncad-Fc или полилизином, трансфицировали через 6 часов после посева дуплексами GFP + αE-катенин РНКи или GFP + RNActr и обрабатывали на 2 DIV. A , Эффект siRNA или RNActr αE-катенина на удлинение нейритов на Ncad-Fc. B , Длина самого длинного нейрита, количественно определенная для двух трансфекций и двух типов субстратов, демонстрирует сильное влияние миРНК αE-катенина на удлинение нейритов на Ncad-Fc, но не на полилизин (PLL). C – E , Микросферы, покрытые 0,3 мкг / см. 2 Ncad-Fc помещали на ростовые конусы нейронов, нанесенных на полилизин, и трансфицировали либо миРНК αE-катенина, либо RNActr, поскольку оптическая ловушка применялась непрерывно. C , Один пример каждого условия: красные трассы представляют 2-минутные траектории, наложенные на изображения DIC, а вставки показывают соответствующую флуоресценцию GFP. D , Соответствующий график зависимости смещения от времени для этих двух примеров, показывающий, что шарик покидает ловушку за 40 с в случае RNActr, но не покидает его раньше, чем через 100 с в случае RNAi. E , Вероятность выхода из ловушки до 1 мин, вычисленная для ∼30 шариков в каждом состоянии (24–30 нейронов для каждого эксперимента). Планки погрешностей указывают на SEM. * p <0,05.
Усиление контактов N-кадгерина связано с локальным рекрутированием актина
Несмотря на значительное смещение, конусы роста медленно трактуются на иммобилизованных лигандах N-кадгерина. В этом процессе актиновая сеть может генерировать силы на небольшое количество достаточно сильных кластеров рецепторов N-кадгерина.Чтобы изучить эту проблему, мы наблюдали за динамическим поведением адгезий актина и N-кадгерина, используя двухцветную покадровую визуализацию актин-GFP и Ncad-DsRed в конусах роста, мигрирующих на субстратах Ncad-Fc. N-кадгерин был распределен довольно равномерно, но иногда образовывал небольшие кластеры на уровне субстрата, которые могли сохраняться в течение 1-2 мин ( A , B ). Актин-GFP часто накапливался в этих богатых Ncad-DsRed кластерах, а затем исчезал по мере растворения кластеров ( A , B , дополнительное видео 6, доступно на www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала). Эти результаты предполагают, что кластеризация нескольких рецепторов N-кадгерина является достаточной для индукции местного и временного накопления актина. В среднем уровень флуоресценции таких кластеров, нормализованный по контрольным областям на тех же конусах роста, составлял 2,08 ± 0,12 для актин-GFP и только 1,36 ± 0,04 для N-кадгерин-DsRed ( n = 22 кластера из 5 котрансфицированных клеток; p <0,001 по тесту Стьюдента t ), выявляя трехкратное различие между N-кадгерином и обогащением актина на этих участках контакта с субстратом, покрытым Ncad-Fc.
Накопление актина в базальных кластерах N-кадгерина. Нейроны, помещенные на покровные стекла, покрытые Ncad-Fc, котрансфицировали Ncad-DsRed и актин-GFP (1: 1). Мы постарались сфокусироваться на уровне субстрата, чтобы выявить распределение N-кадгерина в базальной мембране. A , Пример конуса роста, показывающий временное образование кластеров N-кадгерина (стрелки) параллельно с резким накоплением актина. B , Пример кластера N-кадгерина, который формировался и исчезал несколько раз в одном и том же месте.Интенсивности флуоресценции GFP и DsRed в кластере были нормализованы к интенсивности флуоресценции в соседнем регионе и нанесены на график с течением времени.
Затем мы исследовали, участвует ли механическое сопротивление адгезии N-кадгерина в таком накоплении актина. Мы имитировали жесткие контакты N-кадгерина, накладывая силы на микросферы, покрытые максимальной плотностью Ncad-Fc, и отслеживали перераспределение актина-GFP. Поскольку оптическая ловушка была слишком слабой, чтобы сдерживать движение микросфер, мы использовали более крупные шарики и предотвратили их движение назад, расположив жесткую микроиглу ниже по потоку (Suter et al., 1998), что приводит к постоянному проскальзыванию потока актина под микросферой. Сила, измеренная при отклонении микроиглы, составляла ~ 1 нН, т.е. сила ~ 10-20 гомофильных связей между N-кадгеринами (Perret et al., 2004; Pittet et al., 2008). Таким образом, проскальзывание в этих условиях может включать сложный и случайный разрыв многих связей рецептор-цитоскелет, который невозможно разрешить на индивидуальном уровне, как показано на фиг. Не было особого обогащения актином на неограниченных шариках, когда они двигались назад ( A ).Напротив, удерживаемые микросферы демонстрировали точечное накопление актина в месте приложения силы ( B , дополнительное видео 7, доступно на www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала), которое достигало максимального уровня через 1-2 минуты, затем оставалось довольно постоянный ( C ). Такое накопление актина демонстрирует кинетику и уровни, аналогичные наблюдаемым на покровных стеклах, покрытых Ncad-Fc, что указывает на общий молекулярный механизм. Подобные эксперименты на клетках, трансфицированных Ncad-GFP, показали гораздо более медленное и более равномерное накопление рецепторов Ncad-GFP вокруг гранул, покрытых Ncad-Fc (Thoumine et al., 2006). Следовательно, рекрутирование актина может быть инициировано умеренным накоплением рецепторов N-кадгерина и зависит от силы. Чтобы подтвердить, что накопление актина запускается жесткой связью между адгезиями N-кадгерина и цитоскелетом, мы провели дополнительные эксперименты по микроманипуляции на клетках, коэкспрессирующих NcadΔextra, чтобы нарушить связывание между эндогенным N-кадгерином и потоком актина. В этих условиях только очень кратковременное накопление актин-GFP наблюдалось в контакте с гранулами в первые 2 мин, а затем исчезло в долгосрочной перспективе ( C , D , дополнительное видео 8, доступно на www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала). Кроме того, когда микроигла прикладывалась вперед, мы чувствовали очень слабое сопротивление со стороны этих конусов роста, в отличие от контрольных клеток, трансфицированных одним актином-GFP, в которых конусы роста ползли к вытянутым шарикам (дополнительные видеоролики 7, 8, доступны на www.jneurosci.org в качестве дополнительных материалов).
Локальное накопление актина в ограниченных микросферах Ncad-Fc. A – C , Нейроны, засеянные полилизином, трансфицировали только актином-GFP ( A , B ) или котрансфицировали актином-GFP и NcadΔextra одновременно и наблюдали и наблюдали в светлом поле (слева) и флуоресценции (справа).В момент времени 0 микросферы размером 4 мкм, покрытые 0,3 мкг / см 2 Ncad-Fc, помещали на ростовые конусы с помощью оптического пинцета, затем либо оставляли в покое ( A, ), либо сразу удерживали стеклянной микроиглой ( B). , С ). Траектории через 10 минут отображаются красным цветом, а шарики отображаются через 2 минуты после позиционирования. Свободные микросферы движутся назад ( A ), тогда как удерживаемые шарики тянут экспериментатор в направлении движения конуса роста (снизу вверх в B , C ).Точечное накопление актин-GFP наблюдалось в локусе приложения силы для удерживаемых шариков (стрелка), что отсутствовало в контрольных условиях, то есть в несвязанных шариках ( A ) или в клетках, экспрессирующих NcadΔextra ( C ). ). D , Фактор обогащения был определен как сигнал флуоресценции в контакте с шариком, деленный на сигнал в контрольной зоне на том же конусе роста и нанесенный на график в зависимости от времени. Планки погрешностей указывают на SEM. * p <0.05.
Слабая корреляция между силой связывания N-кадгерина и миграцией конуса роста
Наконец, чтобы определить, было ли продвижение конуса роста каким-либо образом связано с внутренней прочностью адгезии N-кадгерина, мы измерили гомофильную адгезию N-кадгерина в различных условиях. плотность лиганда и сверхэкспрессия мутантных рецепторов. Нейроны, нанесенные на полилизин, инкубировали в течение 30 минут с микросферами, покрытыми Ncad-Fc размером 2 мкм, и неприлипающие шарики смывали ( A , B ) или отделяли центрифугированием культур вверх ногами (данные не показаны).Мы подсчитали, что такие протоколы создавали механические силы ~ 200–250 пН на шарики (см. Материалы и методы), прочность примерно пяти молекулярных мостиков кадгерина (Perret et al., 2004; Pittet et al., 2008). Следовательно, этот анализ долговременной адгезии отражает довольно сильные контакты с участием нескольких молекул N-кадгерина. Количество гранул, оставшихся связанными на клетку, постепенно увеличивалось с увеличением плотности Ncad-Fc (дополнительный рисунок 3 A , доступен на www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала) и сильно снижалось в присутствии EGTA или антител, блокирующих функцию. указывает на специфичность адгезии (дополнительный рис.3 B , C , доступно на www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала). Мы также исследовали адгезию N-кадгерина, в частности, на ростовых конусах, помещая микросферы размером 1 мкм на 2 с на их периферию с помощью оптического пинцета (). Шарики, которые рассеялись в ванне после первоначального контакта, были признаны незакрепленными. Это позволило рассчитать долю прилипших валиков P a , которая измеряет, превышает ли сила адгезии тепловое движение валика.Этот краткосрочный анализ показал в основном ту же тенденцию, что и анализ седиментации (дополнительный рис. 3, доступный на www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала). Как и ожидалось, влияние N-кадгерина на продвижение конуса роста и удлинение нейритов было положительно связано со степенью гомофильной адгезии N-кадгерина, но было несколько контрпримеров. Например, деполимеризующий актин агент цитохалазин D останавливал развитие конуса роста ( H ), не влияя на адгезию N-кадгерина (дополнительный рис.3 A , C , доступны на www.jneurosci.org в качестве дополнительных материалов). Кроме того, сверхэкспрессия рецепторов NcadWT и Ncad-AAA увеличивала связывание гранул ( C ), но уменьшала удлинение нейритов ( B ). Напротив, нейроны, трансфицированные NcadΔextra и NcadΔβcat, показали умеренное снижение адгезивности ( C ), что согласуется с открытием, что связывание кадгерина с β-катенином усиливает адгезию (Chu et al., 2004). В целом, наблюдалась относительно слабая корреляция между адгезией лиганда и ростом аксонов ( D ).Это наблюдение поддерживает идею, что помимо связывания, соединение N-cadherin с цитоскелетом является более четким детерминантом продвижения конуса роста.
Адгезивность мутантов N-кадгерина. Нейроны, культивированные на полилизине, трансфицировали при 1 DIV для каждой из пяти плазмид: GFP, NcadWT-GFP, NcadΔextra, NcadΔβcat-GFP или NcadAAA-YFP. На 2 DIV нейроны инкубировали в течение 30 мин с микросферами 2 мкм, покрытыми 0,3 мкг / см 2 Ncad-Fc, и неприлипающие шарики смывали. A , B , Типичные изображения ДИК ( A ) и соответствующие изображения флуоресценции ( B ) представлены для каждого состояния.Белки, меченные GFP, детектировали с использованием иммуноокрашивания против GFP в условиях проницаемости. NcadΔextra детектировали с помощью моноклонального антитела против внутриклеточного эпитопа N-кадгерина. Гранулы яркие, потому что вторичные антимышиные антитела распознают мышиный Fc-Ncad на поверхности гранул. C , Количество адгезивных шариков на клетку нормализовано по сравнению с контрольным условием GFP. Доля шариков, остающихся на ростовых конусах после 2-секундного контакта с помощью оптического пинцета, также наносится на график для каждой трансфекции (светло-серые столбцы).Это вероятность, которая не позволяет рассчитать планку ошибок. D , Длина нейрита в зависимости от адгезивности N-кадгерина для разведений Ncad-Fc (белые кружки), других лигандов и условий возмущения (серые кружки) и мутантных рецепторов (черные кружки). Количество прикрепленных шариков на клетку в анализе седиментации было нормализовано по отношению к условиям 0,3 мкг / см 2 Ncad-Fc или GFP, соответственно. Линия указывает на линейное соответствие всех данных. Отметим, что параметр корреляции намного слабее, чем с индексом связи ( H , D ).Планки погрешностей указывают на SEM. * p <0,05.
Discussion
Мы рассмотрели здесь вопрос о том, как адгезия N-кадгерина соединяется с динамикой актина, чтобы обеспечить перемещение конусов роста нейронов. Мы специально протестировали модель сцепления, которая рассматривает ретроградный поток актина как двигатель, который бездействует, когда он не сталкивается с адгезией для соединения, но который может вступать в прямое движение, обеспечивая достаточно прочное трансмембранное соединение с лигандами, иммобилизованными на субстрате (Mitchison and Kirschner, 1988; Suter and Forscher, 1998).Мы использовали первичные нейроны, взаимодействующие с плоскими субстратами или микросферами, покрытыми очищенным рекомбинантным N-кадгерином. Такая биомиметическая система позволяет точно контролировать тип и плотность молекул лиганда, представленных клеткам, и начальное время взаимодействия, что невозможно в естественных контактах, которые образуются в произвольные моменты времени и где могут сосуществовать различные типы адгезионных белков. в неизвестной стехиометрии. Схема эксперимента кратко изложена в.
Сводная схема основных выводов. A , При высокой плотности покрытия Ncad-Fc на микросфере, соответствующей сильно адгезивному субстрату, образуется много связей лиганд-рецептор-актин, что приводит к сильному взаимодействию с ретроградным потоком и выходу шариков из оптического пинцета . Это имитирует податливый субстрат, который не обладает достаточным сопротивлением клеточному сцеплению. B , При более низкой плотности Ncad-Fc, соответствующей слабой адгезивной подложке, образуется только несколько лиганд-рецепторных связей, которых недостаточно для стабильного соединения гранулы с ретроградным потоком актина.Иногда образуется связь лиганд-рецептор-актин, и шарик начинает двигаться назад, но разрыв отдельной связи на уровне катенина под действием сил pN заставляет шарик защелкнуться обратно в оптическую ловушку. C , При высокой плотности покрытия Ncad-Fc шарик удерживается от движения назад с помощью жесткой микроиглы, имитирующей жесткую подложку. Это вызывает локальное накопление актина на грануле, что делает контакт жестким и позволяет конусу роста захватить субстрат и продвинуться вперед.
Нашим основным результатом является сильная корреляция между скоростью продвижения конуса роста на N-кадгерине и механической связью между лиганд-связанными рецепторами N-кадгерина и потоком актина в условиях различной плотности лиганда и экспрессии мутировавших рецепторов N-кадгерина. . Напротив, когда связывание только N-кадгерина измеряли с помощью анализов адгезии гранул, мы наблюдали гораздо более слабую корреляцию между адгезией лиганда и ростом аксонов, подтверждая предыдущие результаты, полученные для нейронов DRG, нанесенных на субстраты N-кадгерина, L1 или полилизина (Lemmon et al. al., 1992). Таким образом, наши данные подтверждают прямую механическую связь между связанными с лигандом рецепторами N-кадгерина и актиновой сетью, движущейся назад, позволяя тяговым силам передаваться на субстрат и приводя к прогрессированию вперед (Mitchison and Kirschner, 1988; Suter and Forscher, 1998). Процесс связывания, вероятно, будет регулироваться выборочно для каждой молекулы адгезии, как показано для члена L1 IgCAM, который может задействовать поток актина через анкирин при инициировании нейритов, но не при удлинении аксонов (Gil et al., 2003; Nishimura et al., 2003). Такой пространственный контроль, по-видимому, специфичен для L1, поскольку L1 также активно рециркулируется от основания к верхушке конусов роста посредством клатрин-зависимого переноса и, таким образом, демонстрирует градиент распределения на поверхности конуса роста (Kamiguchi and Yoshihara, 2001; Dequidt и др., 2007).
Здесь мы сосредоточились на более поздних стадиях удлинения аксонов и показали, что только N-кадгерин обладает сильной способностью как способствовать транслокации конуса роста, так и соединяться с потоком актина.Действительно, контрольная молекула кадгерин-11 показала очень слабое сцепление, но слегка стимулировала рост аксонов ( H ), эффект, который может включать путь трансдукции, включающий внеклеточное связывание цис- с рецептором FGF (Saffell et al., 1997; Бошер и Меге, 2008 г.). Напротив, SynCAM, который, как сообщалось, действует как транс-синаптический мост за счет сильного гомофильного связывания (Biederer et al., 2002; Breillat et al., 2007), довольно хорошо соединяется с потоком актина, но полностью неспособен поддерживать ростовой конус. прогрессия.Одна возможность объяснить этот результат состоит в том, что адгезии synCAM настолько прочны, что они не могут отслоиться и тем самым нарушить продвижение конуса роста. О таком эффекте сообщалось для фибробластов, мигрирующих на фибронектин, где при высоких уровнях адгезии клетка-субстрат скорость клеток ограничена нарушением связей цитоскелет-интегрин-внеклеточный матрикс сзади (Palecek et al., 1997). В этом отношении время жизни адгезии N-кадгерина на конусах роста нейронов, измеренное с помощью экспериментов по восстановлению флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) на контактах гранул, покрытых Ncad-Fc, находится в диапазоне нескольких десятков минут (Thoumine et al., 2006). Это точно соответствует времени, которое потребуется для того, чтобы адгезия, образовавшаяся на периферии конуса роста, оторвалась сзади (т.е. на ~ 10 мкм дальше), при этом конус роста перемещается со скоростью 0,1–1 мкм / мин. Такой относительно быстрый оборот адгезий N-кадгерина, по-видимому, особенно приспособлен для передвижения конусов роста из нейронов гиппокампа. В качестве другого примера, мутант NcadAAA, у которого время жизни гомофильных связей в три раза выше, чем у NcadWT (Thoumine et al., 2006), также демонстрирует снижение прогрессирования нейритов, что может быть связано с высокой адгезивностью.
Трансфекция рецепторов N-кадгерина, мутировавших в областях связывания катенина, уменьшала как цитоскелетное связывание, так и удлинение нейритов, демонстрируя, что сцепление непосредственно включает партнеров катенина. Мутант NcadΔextra, который несет только трансмембранный домен и внутриклеточный хвост N-кадгерина, действует как прямой конкурент на поверхности клетки для взаимодействий N-кадгерина со всеми внутриклеточными партнерами и, как таковой, имел наиболее выраженные и специфические эффекты в этих анализах. . Мы попытались использовать конструкции NcadΔβcat и NcadAAA для более избирательного возмущения взаимодействий катенина, аргументируя это тем, что, конкурируя за связывание лиганда Ncad-Fc на гранулах, эти мутировавшие рецепторы должны уменьшать связь между эндогенными рецепторами N-кадгерина и актином, и, следовательно, скорость конуса роста. на сайте Ncad-Fc.В самом деле, β-catenin, как хорошо известно, физически связывает рецепторы кадгерина с актиновыми филаментами посредством связывания с α-catenin (Mege et al., 2006). Напротив, известно, что катенин p120 модулирует адгезивность кадгерина (Ozawa and Kemler, 1998; Yap et al., 1998; Thoumine et al., 2006) и, как сообщается, связывает корактин (El Sayegh et al., 2004), обеспечивая потенциальную параллельный путь для соединения N-кадгерина с актиновой сетью. Однако эффекты NcadΔβcat и NcadAAA не были полностью специфичными для субстрата Ncad-Fc, поскольку эти мутанты также снижали рост нейритов на стекле, покрытом ламинином.Это может быть отчасти связано с потенциальным перекрестным взаимодействием между кадгеринами и интегринами (например, было показано, что юкстамембранный домен кадгерина, с которым связывается p120, регулирует опосредованную интегрином адгезию и рост нейритов) (Lilien et al., 1999), и N- кадгерин является частью белкового комплекса, включающего NCAM, который стимулирует рост нейритов с помощью механизма, зависимого от интегрина и рецептора FGF (Cavallaro et al., 2001). Тем не менее, NcadΔβcat также демонстрирует более высокую скорость оборота адгезива, как измерено с помощью FRAP (Thoumine et al., 2006), что приводит к снижению адгезивности () и, как таковое, не действует как хороший конкурент для связывания лиганда. Кроме того, мы отметили систематическое снижение скорости гранул Ncad-Fc в конусах роста нейронов, трансфицированных NcadAAA, что отражает более медленную скорость потока актина, что может объяснять более высокий ингибирующий эффект NcadAAA на длину нейритов. Один из механизмов, с помощью которого экспрессия NcadAAA может замедлить ретроградный поток актина, заключается в том, чтобы оставить часть p120 свободной для взаимодействия с другими партнерами, такими как малые GTPases (Rac / Rho), которые, как известно, влияют на динамику актина (Elia et al. ., 2006). В качестве альтернативы, поскольку p120 участвует в рециклировании N-кадгерина на плазматической мембране (Chen et al., 2003; Davis et al., 2003), возможно, что снижение продвижения конуса роста, наблюдаемое для мутанта NcadAAA на Ncad -Fc-субстрат является следствием такого измененного трафика. В целом, эти наблюдения могут объяснить результаты экспериментов in vivo на ганглиозных клетках сетчатки, которые показали, что область внутриклеточного хвоста N-кадгерина перед сайтом связывания β-катенина, где связывается p120, имеет решающее значение для аксоногенеза (Riehl et al., 1996).
Таким образом, использование мутировавших рецепторов достигло некоторых пределов, мы приняли другую стратегию, используя siRNA против α-катенина. Эффективное подавление α-catenin в нейронах привело к специфическому ингибированию расширения нейритов на субстратах Ncad-Fc и связывания с актином, что представляет собой лучшее доказательство участия катенина в механизме сцепления. Эти данные хорошо согласуются с недавно появившейся ролью α-катенина как ключевой молекулы на границе между межклеточной адгезией и динамикой актина (Kobielak and Fuchs, 2004; Drees et al., 2005).
Показывая события повторного захвата в оптической ловушке, мы также предоставляем убедительные доказательства непрерывного разрыва связей между рецепторами N-кадгерина и актином при малых силах. Поскольку эти шарики, покрытые небольшим количеством лигандов N-кадгерина, вероятно, будут прикрепляться к очень немногим рецепторам (Thoumine and Meister, 2000), события повторного захвата были интерпретированы как разрыв небольшого количества молекулярных связей. Поскольку задействованные силы намного ниже, чем взаимодействие 30–100 пН между отдельными молекулами кадгерина (Perret et al., 2004; Pittet et al., 2008), и поскольку шарики остаются прикрепленными к поверхности ростового конуса, когда ловушка останавливается, разрыв между лигандами N-кадгерина и рецепторами маловероятен. Вместо этого события повторного захвата 1 pN более вероятно соответствуют разрыву одинарных связей между комплексом кадгерин-катенин и актином, которые, как предполагалось ранее, являются высокодинамичными (Drees et al., 2005). Более высокие значения силы могут быть кратными единичному значению 1 пН и соответствовать одновременному разрыву нескольких связей.Вовлеченные здесь силы аналогичны связи 2 pN между тримерами интегрина и актиновым цитоскелетом через талин, о которых сообщается в фибробластах (Jiang et al., 2003), предполагая, что проскальзывание при низких силах является общим механизмом, лежащим в основе закрепления актина на связанных с субстратом лигандах. .
Применяя более высокие силы, мы смогли ограничить микросферы и локально остановить поток актина. Затем мы наблюдали поразительное накопление актин-GFP в области контакта гранул, которое также наблюдалось на участках кластеров N-кадгерина, соприкасающихся с субстратом.Тот факт, что в обоих анализах актин накапливался до более высоких уровней, чем рецепторы N-кадгерина, подтверждает различную динамику комплексов актин и кадгерин-катенин в сайтах адгезии (Yamada et al., 2005) и предполагает своего рода усиление, а не только пассивное рекрутирование ранее существовавших актиновых филаментов. Мы предлагаем механизм, основанный на локальной полимеризации актина, управляемой механической силой, приложенной к кластерам рецепторов N-кадгерина, как это наблюдается в миогенных клетках с использованием паттернированного обнаружения силы с помощью микростолбиков (Ganz et al., 2006). Возможно, что возникающие адгезии N-cadherin могут инициировать такой процесс за счет мобилизации молекул α-catenin в противном случае в конкуренции с нуклеирующим комплексом Arp2 / 3 (Drees et al., 2005). Действительно, накопление -катенин-GFP также наблюдалось в анализе с микроиглами (данные не показаны), и рекрутирование актина в микросферы предотвращалось сверхэкспрессией мутанта NcadΔextra, который конкурировал за связывание партнеров катенина. Альтернативно, накопление актина может быть связано с другими путями, например, активацией Rac1, который, как мы ранее сообщали, опосредует закрепление N-кадгерина в потоке актина (Lambert et al., 2002), или активация рецептора FGF и передача сигналов ниже по течению через липазный путь фосфолипазы C-γ / DAG и регуляцию кальция (Saffell et al., 1997; Boscher and Mege, 2008). В любом случае локальное накопление актина в жестких контактах N-кадгерина может служить для усиления адгезивного комплекса и действовать как движущая сила для расширения конуса роста ниже лигандирования N-кадгерина.
В заключение, наши данные предполагают, что N-кадгерин оказывает нейритогенный эффект в нейронах ЦНС позвоночных, стимулируя миграцию конусов роста через механизм молекулярного сцепления, при этом катенины являются частью комплекса, передающего силу актиновым филаментам.
Купить Клапан управления потоком гидравлической муфты Tilton — 90-5000
Информация о платежах
Плата за 30 дней
Сделайте покупку сегодня, чтобы попробовать перед покупкой. Платите только за то, что оставляете. Платите до 30 дней позже. Нет интереса. Нет сборов. Никакого влияния на ваш кредитный рейтинг.
Оплата после доставки позволяет попробовать перед покупкой и является самым простым способом делать покупки в Интернете.
- Завершите оплату полностью после покупки без дополнительных затрат.
- Report возвращается прямо в нашем приложении и платит только за то, что у вас осталось.
- Несвоевременная оплата может повлиять на вашу способность использовать Klarna в будущем.
- Коллекторские агентства используются в крайнем случае
Чтобы иметь право на это кредитное предложение, вы должны быть старше 18 лет и проживать в Великобритании. Условия и положения Pay Later
Оплатить 3 беспроцентными платежами
Разложите стоимость покупки на 3 беспроцентных платежа.Первый платеж производится в момент покупки, а оставшиеся платежи планируются автоматически каждые 30 дней. Никаких процентов или сборов. Выберите опцию Klarna и введите данные своей дебетовой или кредитной карты. Чтобы проверить ваше право на участие, Klarna выполнит мягкий поиск в агентстве кредитной информации. Это не повлияет на ваш кредитный рейтинг.
Нет процентов. Нет сборов. Никакого влияния на ваш кредитный рейтинг.
- Новый способ оплаты, альтернативный кредитной карте.
- 3 рассрочки дает вам возможность совершать покупки без процентов или скрытых комиссий.
- Несвоевременная оплата может повлиять на вашу способность использовать Klarna в будущем.
- Коллекторские агентства используются в крайнем случае.
Чтобы иметь право на это кредитное предложение, вы должны быть старше 18 лет и проживать в Великобритании. Платежи в 3 положениях и условиях
Demon Tweeks выступает в качестве распространителя, а не кредитора нерегулируемых кредитных продуктов, предоставляемых Klarna Bank AB (publ). Кредит доступен только постоянным резидентам Великобритании в возрасте 18+, в зависимости от статуса, применяются Условия и положения.
Обратите внимание, что оплата в течение 30 дней и оплата тремя частями не регулируется FCA. Заимствование сверх ваших средств может серьезно повлиять на ваше финансовое положение, поэтому убедитесь, что вы можете позволить себе произвести выплаты вовремя в установленный срок.